વિભાગ "આનુવંશિક ઇજનેરી". કોષમાં રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ દાખલ કરવા માટેની પદ્ધતિઓ કોષમાં રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ દાખલ કરવા માટેની પદ્ધતિઓ

કોષોમાં જનીન વિતરણ પ્રણાલી માટેના સૌથી આશાસ્પદ વિકલ્પો પૈકી એક છે પોલીપ્લેક્સ - ટ્રાન્સફર કરાયેલ ડીએનએના સંકુલ અને વિવિધ પ્રકૃતિના કેશનિક પોલિમર. આ લેખ વિવિધ પ્રકારના કેશનિક પોલિમરના આધારે પોલિપ્લેક્સના ગુણધર્મો, લક્ષ્ય કોષોના મધ્યવર્તી કેન્દ્રમાં તેમના પરિવહન, તેમજ આ રચનાઓનો ઉપયોગ કરીને જીવલેણ નિયોપ્લાઝમની સારવાર માટેના એક અભિગમનું વર્ણન કરે છે.

પરિચય

જીન થેરાપી એ વારસાગત, ઓન્કોલોજિકલ અને અન્ય રોગોની સારવાર છે જે દર્દીના કોષોમાં આવશ્યક આનુવંશિક સામગ્રીને દાખલ કરીને ખાસ કરીને જનીન ખામીને બદલવા અથવા કોષોને નવા કાર્યો આપે છે [ગોર્બુનોવા એટ અલ., 1997]. લક્ષ્ય કોષોને ડીએનએ અથવા આરએનએ પહોંચાડવા માટે, ઉચ્ચ સ્તરના ટ્રાન્સફેક્શનની ખાતરી કરવા માટે કેરિયર્સ (વેક્ટર) બનાવવામાં આવે છે, એટલે કે. એક્સોજેનસ (વિદેશી) ડીએનએ અથવા આરએનએનું ચોક્કસ પ્રકારના કોષોમાં સ્થાનાંતરણ. વધુમાં, વેક્ટર્સે આનુવંશિક માહિતીના રક્ષણની ખાતરી કરવી જોઈએ, કારણ કે વિવોની પરિસ્થિતિઓમાં, સીરમ ન્યુક્લીઝ, એન્ઝાઇમ કે જે ન્યુક્લીક એસિડને તોડી નાખે છે તેના ઝડપી અધોગતિને કારણે વિદેશી ડીએનએ અસ્થિર છે.

આનુવંશિક સામગ્રી પરિવહનકારોના પ્રકાર

પ્રકૃતિમાં, કોષો - વાયરસમાં આનુવંશિક માહિતી પહોંચાડવા માટે વિશિષ્ટ માળખાં છે. તેથી, તેઓ જીન ટ્રાન્સપોર્ટર્સ તરીકે ઉપયોગમાં લેવા લાગ્યા. તે જ સમયે, વાયરલ વેક્ટરનો ઉપયોગ ઘણી મર્યાદાઓ ધરાવે છે. પ્રથમ, આ સ્થાનાંતરિત આનુવંશિક સામગ્રીની નાની ક્ષમતા અને વાયરસની અંતર્ગત સેલ્યુલર વિશિષ્ટતા છે. બીજું, સમાન પ્રકારના ચેપના પેસેજ દરમિયાન પુનઃસંયોજનના પરિણામે વાયરસ જંગલી પ્રકાર પર પાછા ફરવાની આ શક્યતા છે. ત્રીજે સ્થાને, વાયરલ કણોના પ્રોટીન અત્યંત રોગપ્રતિકારક હોય છે, જેના પરિણામે તેમના પુનરાવર્તિત વહીવટ રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવનું કારણ બને છે. છેવટે, વાયરલ વેક્ટરનું મોટા પાયે ઉત્પાદન હજુ પણ તદ્દન સમસ્યારૂપ અને ખર્ચાળ છે. હાલમાં, cationic લિપિડ્સ અને cationic પોલિમર પર આધારિત બિન-વાયરલ કેરિયર્સ માટેના વિવિધ વિકલ્પો સક્રિયપણે વિકસાવવામાં આવી રહ્યા છે. આ કેશનિક પરમાણુઓ ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ ડીએનએ પરમાણુ સાથે સ્વયં-એસેમ્બલ નેનોકોમ્પ્લેક્સને સ્વયંભૂ બનાવવા માટે સક્ષમ છે. કેશનિક લિપિડ્સ અને ડીએનએ ધરાવતા સ્વ-એસેમ્બલ કોમ્પ્લેક્સને લિપોપ્લેક્સ કહેવામાં આવે છે; જે કેશનિક પોલિમર અને ડીએનએ ધરાવે છે તેને પોલિપ્લેક્સ કહેવામાં આવે છે.

પોલીપ્લેક્સ બનાવવા માટે કેશનીક પોલિમરનો ઉપયોગ થાય છે

જીન થેરાપી અને બાયોટેકનોલોજીના હેતુઓ માટે મોટી સંખ્યામાં કેશનિક પોલિમર અથવા પોલિકેશન્સનો પ્રસ્તાવ મૂકવામાં આવ્યો છે. પોલિકેશન્સ ડીએનએને કોમ્પેક્ટ નેનોકોમ્પ્લેક્સમાં ઘટ્ટ કરે છે, જે ડીએનએ સ્થિરતા અને ન્યુક્લિઝથી રક્ષણ પૂરું પાડે છે. કેશનિક પ્રોટીન, એમિનો એસિડના કૃત્રિમ હોમોપોલિમર્સ (પોલીલિસાઇન્સ, પોલિઆર્જિનિન), ચિટોસન પોલિસેકરાઇડ, પોલિઇથિલેનિમાઇન, વિવિધ રચનાઓના ડેન્ડ્રીમર્સ અને અન્ય સંશોધિત પોલિમર ડીએનએ-બંધનકર્તા પોલિમર તરીકે સેવા આપી શકે છે. ડીએનએ કોમ્પેક્શનની ડિગ્રી કોમ્પ્લેક્સના કુલ ચાર્જ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે, જે બદલામાં, હકારાત્મક પોલિમર જૂથોની સંખ્યા અને ડીએનએના નકારાત્મક ફોસ્ફેટ જૂથોની સંખ્યાના ગુણોત્તર પર આધારિત છે. સામાન્ય રીતે, પોલીપ્લેક્સની રચનામાં, પોલીકેશન વધુ પડતું હોય છે, જેના પરિણામે નેનો-કદના સંકુલ (કેટલાક દસથી લઈને કેટલાક સો એનએમ) બને છે, જે પાણીમાં દ્રાવ્ય હોય છે અને હકારાત્મક રીતે ચાર્જ થાય છે (ફિગ. 1, 2) ). નહિંતર, સંકુલ અસ્થિર હશે.

ચોખા. 1. કેશનિક પોલિમર અને ગોળાકાર ડીએનએ પરમાણુ (પ્લાઝમિડ)માંથી પોલીપ્લેક્સની રચનાની યોજના. ચોખા. 2. ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન માઇક્રોસ્કોપી (સ્કેલ ડિવિઝન 200 એનએમ) નો ઉપયોગ કરીને મેળવેલ સબસ્ટ્રેટ પર પોલિપ્લેક્સની છબી.

જનીન ડિલિવરી માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સૌપ્રથમ પોલિકેશનમાંનું એક પોલિ-એલ-લાયસિન (PL, ફિગ. 3) હતું, જે તેના પેપ્ટાઈડ સ્વભાવને કારણે બાયોડિગ્રેડેબલ છે, જે તેને વિવોમાં ઉપયોગ માટે અત્યંત અનુકૂળ બનાવે છે. ઘણીવાર, ઉચ્ચ સપાટીના ચાર્જ ઘનતા સાથે સંકળાયેલ અનિચ્છનીય અસરોને દૂર કરવા માટે, પોલિઇથિલિન ગ્લાયકોલ (PEG) સાથે PL ના કોપોલિમરનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે. આ ફેરફારના પરિણામે, કોમ્પ્લેક્સની સપાટીનો ચાર્જ ઘટે છે, જે પોલીપ્લેક્સીસ પર નકારાત્મક ચાર્જ સીરમ પ્રોટીનના બિન-વિશિષ્ટ શોષણને અટકાવે છે, અને સંકુલની સાયટોટોક્સિસિટી પણ ઘટાડે છે.

પોલિએથિલેનિમાઇન (PEI, ફિગ. 3) તેના આધારે પોલીપ્લેક્સ બનાવવા માટે પોલિકેશન્સ માટેના સૌથી આશાસ્પદ વિકલ્પો પૈકી એક ગણવામાં આવે છે. PEI બે સ્વરૂપોમાં સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે: રેખીય અને ડાળીઓવાળું. PEI પાસે મોટી સંખ્યામાં એમિનો અને ઇમિનો જૂથો છે જે પ્રોટોનેશન માટે સક્ષમ છે, જેના પરિણામે તે શારીરિક પરિસ્થિતિઓમાં બફરિંગ ગુણધર્મો દર્શાવે છે. PEI પર આધારિત પોલીપ્લેક્સ અન્ય પોલિકેશનની તુલનામાં વધુ કાર્યક્ષમ ટ્રાન્સફેક્શન અને ન્યુક્લિઝની ક્રિયાથી રક્ષણ દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે, જે PEI પર ઉચ્ચ ચાર્જ ઘનતા અને વધુ કોમ્પેક્ટ DNA ફોલ્ડિંગ સાથે સંકળાયેલ છે. મજબૂત હકારાત્મક ચાર્જ PEI ની ઝેરી અસર તરફ દોરી જાય છે, જે PEI ના જૈવિક અધોગતિના અભાવ સાથે, વિવોમાં PEI ના ઉપયોગ માટેના પરિબળોને મર્યાદિત કરે છે. સાયટોટોક્સિસિટી ઘટાડવા માટે, PEI ને પોલિઇથિલિન ગ્લાયકોલ સાથે સંશોધિત કરવામાં આવે છે, જે ઓછી ઝેરી અને ઉચ્ચ હાઇડ્રોફિલિસિટી ધરાવે છે.

ચોખા. 3. પોલીપ્લેક્સ બનાવવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા કેશનિક પોલિમર, અને.

આનુવંશિક માહિતીના વિતરણમાં ઉપયોગમાં લેવાતા પોલિકેશનના અન્ય પ્રતિનિધિ પોલિમિડોમાઇન (PAMAM, ફિગ. 3) છે. આ સંયોજનો અત્યંત શાખાવાળા ડેન્ડ્રીમર છે. બ્રાન્ચિંગ માટે આભાર, PAMAM માં ખૂબ જ લવચીકતા હોય છે, તેઓ ડીએનએને વધુ સારી રીતે કોમ્પેક્ટ કરે છે, અને તેમના પર આધારિત પોલીપ્લેક્સ અન્ય તમામ કરતા વધુ સ્થિર હોય છે. તેના ગુણધર્મો PEI સાથે ઘણું સામ્ય ધરાવે છે.

ચિટોસન્સ (ફિગ. 3) એ ડી-ગ્લુકોસામાઇન અને એન-એસિટિલ-ડી-ગ્લુકોસામાઇન (1>4) ગ્લાયકોસિડિક બોન્ડ દ્વારા જોડાયેલા પોલિસેકરાઇડ્સ છે. પરમાણુ વજન અને ડીસીટીલેશનની ડિગ્રીના આધારે, ચિટોસન્સ ટ્રાન્સફર કરાયેલ ડીએનએ સાથે વિવિધ કદના સ્થિર સંકુલ બનાવે છે. નાના, અથવા તેનાથી વિપરીત, ખૂબ મોટા ચિટોસન પોલિમર ટ્રાન્સફર કરેલ જનીનની અભિવ્યક્તિમાં ઘટાડો તરફ દોરી જાય છે. ચિટોસન આધારિત પોલીપ્લેક્સનો મુખ્ય ફાયદો બાયોડિગ્રેડબિલિટી છે.

પોલિપ્લેક્સની ડિલિવરી કાર્યક્ષમતા ઘણા પરિબળોથી પ્રભાવિત થાય છે: પરમાણુ વજન, શાખાઓની ડિગ્રી, પોલિમરાઇઝેશન અને પોલિમરનો પ્રકાર, કણોનું કદ, દ્રાવણની આયનીય શક્તિ, સંકુલની સપાટીના શુલ્ક, તેમજ પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ. શ્રેષ્ઠ અભિગમમાં આમાંના દરેક પરિબળો અને સંકુલના ગુણધર્મો પરના તેમના પ્રભાવ, લક્ષ્ય કોષો દ્વારા સંકુલનો શોષણ અને ઝેરી અસરને ધ્યાનમાં લેવી જોઈએ.

લક્ષ્ય કોષો પર પોલીપ્લેક્સની ક્રિયાની વિશિષ્ટતાને સુનિશ્ચિત કરવા માટે ઘણા અભિગમો છે. તેમાંના એકમાં ચોક્કસ પ્રકારના કોષોને નેનોકોમ્પ્લેક્સની લક્ષિત ડિલિવરીનો સમાવેશ થાય છે. આ અભિગમ પોલીપ્લેક્સમાં ઘટકો (લિગાન્ડ્સ) ના ઉમેરા સાથે સંકળાયેલ છે, રીસેપ્ટર્સ જેના માટે લક્ષ્ય કોષોની સપાટી પર મોટી માત્રામાં હાજર છે. વિવિધ પ્રોટીન, શર્કરા, પેપ્ટાઈડ્સ, એન્ટિબોડીઝ વગેરેનો ચોક્કસ લિગાન્ડ તરીકે ઉપયોગ થાય છે. અન્ય વ્યૂહરચના એ પરિવહનક્ષમ જનીનોનો ઉપયોગ કરવાની છે જે ફક્ત અમુક કોષોમાં જ સક્રિય હશે, જ્યારે સંકુલની ડિલિવરી બિન-વિશિષ્ટ રીતે થાય છે, એટલે કે, કોઈપણ કોષોને.

લક્ષ્ય કોષોમાં પોલીપ્લેક્સનું ઘૂંસપેંઠ

આનુવંશિક સામગ્રી પહોંચાડવાની પ્રક્રિયામાં બે તબક્કાઓનો સમાવેશ થાય છે: બાહ્યકોષીય (ઇન્જેક્શન સાઇટથી લક્ષ્ય કોશિકાઓ સુધીનો માર્ગ) અને અંતઃકોશિક (લક્ષ્ય કોષો સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા, એન્ડોસાયટોસિસ, એન્ડોસોમ્સમાંથી બહાર નીકળવું, ન્યુક્લિયસ સુધી પહોંચાડવું). પોલીપ્લેક્સના અંતઃકોશિક પરિવહન માર્ગો આકૃતિ 4 માં રજૂ કરવામાં આવ્યા છે.

પોલીપ્લેક્સને લક્ષ્ય કોષ તરફ જવાના માર્ગમાં પ્રથમ અવરોધ જે દૂર કરવાની જરૂર છે તે રક્ત અને બાહ્યકોષીય મેટ્રિક્સ છે. તેથી જ તેની સ્થિરતા વધારવા, બિન-વિશિષ્ટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ ટાળવા અને રોગપ્રતિકારક પ્રતિભાવની સંભાવનાને ટાળવા માટે સંકુલના આવા ભૌતિક રાસાયણિક પરિમાણો પસંદ કરવા જરૂરી છે. સૌપ્રથમ, પોલીપ્લેક્સમાં ડીએનએ એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર ન્યુક્લીઝની ક્રિયાથી સુરક્ષિત હોવું જોઈએ. બીજું, નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ રક્ત સીરમ પ્રોટીન (આલ્બ્યુમિન, ફાઈબ્રિનોજન, ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન, વગેરે), તેમજ એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ પ્રોટીન (કોલાજેન્સ) ચાર્જ્ડ નેનોકોમ્પ્લેક્સની સપાટી પર શોષવામાં સક્ષમ છે, જે પોલીપ્લેક્સની સપાટીના ચાર્જમાં ફેરફાર તરફ દોરી જાય છે. , સંકુલના કદમાં વધારો અને તેમના એકત્રીકરણ તરફ દોરી જાય છે. જ્યારે પોલીપ્લેક્સ શરીરમાં દાખલ થાય છે, ત્યારે તે આંશિક રીતે પેશીઓમાં એકઠા થાય છે અને ફેગોસાયટોસિસમાંથી પસાર થાય છે. આ કારણોસર, પોલીપ્લેક્સનું સ્થાનિક વહીવટ (ઉદાહરણ તરીકે, કેન્સરમાં ગાંઠમાં) ઘણીવાર પેશી કોશિકાઓ સાથેની તેમની બિન-વિશિષ્ટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના આધારે વપરાય છે.

ચોખા. 4. પોલીપ્લેક્સના પરિવહન માટે અંતઃકોશિક માર્ગો.

પોલીપ્લેક્સ સૌપ્રથમ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનમાં શોષાય છે, જે એન્ડોસાયટોસિસ દ્વારા લેવામાં આવે છે, ત્યારબાદ તેઓએ એન્ડોલિસોસોમ્સ છોડીને ન્યુક્લિયસમાં પ્રવેશવા માટે પરમાણુ પરબિડીયું પાર કરવું જોઈએ. ત્યાં વૈકલ્પિક પરિવહન માર્ગો પણ છે જે હંમેશા સંકુલને ન્યુક્લિયસ સુધી પહોંચાડવા તરફ દોરી જતા નથી. વધુમાં, સ્થાનાંતરિત જનીનની અભિવ્યક્તિ માટે પોલિપ્લેક્સને કેશનિક પોલિમર અને ફ્રી ડીએનએમાં વિયોજનની જરૂર છે.

કોષોને લક્ષ્ય બનાવવા માટે આનુવંશિક સામગ્રી પહોંચાડવાનો આગળનો તબક્કો પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન સાથેની તેમની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અને કોષ દ્વારા શોષણ છે. ઉપર નોંધ્યું છે તેમ, લિગાન્ડની ગેરહાજરીમાં કોષો સાથે પોલીપ્લેક્સનું બંધન એ નકારાત્મક રીતે ચાર્જ થયેલ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેન સાથે ઇલેક્ટ્રોસ્ટેટિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના પરિણામે બિન-વિશિષ્ટ રીતે થાય છે. મોટા ભાગના કિસ્સાઓમાં, આવા પોલીપ્લેક્સ બિન-વિશિષ્ટ શોષણયુક્ત એન્ડોસાયટોસિસ દ્વારા શોષાય છે. સંકુલમાં લિગાન્ડનો સમાવેશ કરીને, ક્લેથ્રિન-આશ્રિત રીસેપ્ટર-મધ્યસ્થ એન્ડોસાયટોસિસ દ્વારા શોષણ પ્રાપ્ત કરી શકાય છે. અન્ય ગ્રહણ માર્ગો કોષના પ્રકાર પર આધાર રાખે છે અને તેમાં ફેગોસાયટોસિસ અને કેવિઓલિન આધારિત એન્ડોસાયટોસિસનો સમાવેશ થાય છે. પોલીપ્લેક્સીસની સેલ્યુલર ડિલિવરી સુધારવા માટેની એક વ્યૂહરચના વાઈરલ એન્ટ્રી પેપ્ટાઈડ્સનો ઉપયોગ કરે છે, જેમ કે TAT પેપ્ટાઈડ, જે પહેલા HIV-1 વાયરસથી અલગ કરવામાં આવે છે. આ સિક્વન્સનો ઉપયોગ સુનિશ્ચિત કરે છે કે રચનાઓ કોષમાં પ્રવેશે છે અને પોલીપ્લેક્સને સેલ ન્યુક્લિયસમાં પહોંચાડે છે.

પોલીપ્લેક્સના પરિવહન માર્ગના સૌથી મહત્વપૂર્ણ તબક્કાઓમાંનું એક એ એન્ડોસોમ્સમાંથી બહાર નીકળવું છે. જેમ જાણીતું છે, એન્ડોસોમ એ ટ્યુબ અને વેસિકલ્સની સિસ્ટમ છે, જે શોષિત મેક્રોમોલેક્યુલ્સને વર્ગીકૃત કરવા માટે જરૂરી છે. સૉર્ટિંગ એન્ડોસોમ પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનની નજીક સ્થિત છે. પ્રોટોન પંપના કાર્યને લીધે, તેમનું pH ઘટે છે (એન્ડોસોમના વર્ગીકરણમાં લગભગ 6.5). જ્યારે અંતમાં એન્ડોસોમ્સમાં પર્યાવરણનું વધુ એસિડિફિકેશન થાય છે અને મેક્રોમોલેક્યુલ્સ લિસોસોમ્સમાં પ્રવેશ કરે છે ત્યારે વધુ પરિવહન કાં તો એક્સ્ટ્રામેમ્બ્રેન સ્પેસમાં શોષિત અણુઓના પ્રકાશન સાથે રિસાયક્લિંગ પાથ સાથે અથવા લિટિક પાથ સાથે આગળ વધી શકે છે. લાઇસોસોમ્સમાં, સમાવિષ્ટો પીએચ 5 પર એસિડિફાઇડ થાય છે, અને શોષિત પરમાણુઓ હાઇડ્રોલિટીક એન્ઝાઇમ્સ દ્વારા ડિગ્રેડ થાય છે જે નીચા pH પર સક્રિય થાય છે. ડિગ્રેડેશન પ્રોડક્ટ્સને કોષમાંથી એક્સોસાયટોસિસ દ્વારા દૂર કરવામાં આવે છે અથવા સાયટોપ્લાઝમમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવે છે, જ્યાં તેનો ઉપયોગ મકાન સામગ્રી તરીકે થાય છે.

એવું માનવામાં આવે છે કે PEI-આધારિત પોલીપ્લેક્સ, તેમના ગુણધર્મોને લીધે, કહેવાતા "પ્રોટોન સ્પોન્જ અસર" ને કારણે એન્ડોસોમ્સમાંથી બહાર નીકળવામાં સક્ષમ છે. આ પૂર્વધારણા એ હકીકત પર આધારિત છે કે કેશનિક પોલિમર, બિનપ્રોટોનેટેડ ગૌણ અને તૃતીય એમાઇન્સની હાજરીને કારણે, બફર અસર બનાવે છે, પરિણામે H±ATPase, જે પ્રોટોનને એન્ડોસોમમાં પમ્પ કરે છે, તે વધુ સક્રિય રીતે કામ કરવાનું શરૂ કરે છે. આ કિસ્સામાં, એન્ડોસોમ્સની અંદર ક્લોરિન આયન એકઠા થાય છે. પરિણામે, ઓસ્મોટિક દબાણમાં તીવ્ર વધારો થવાને કારણે સોજો અને લિસિસ થાય છે, જે પોલીપ્લેક્સને સાયટોસોલમાં અકબંધ પ્રવેશવાની મંજૂરી આપે છે. પોલીપ્લેક્સીસ માટે એન્ડોસોમ્સમાંથી બહાર નીકળવાની બીજી પદ્ધતિ સૂચવવામાં આવી છે, જેમાં નેનોકોમ્પ્લેક્સીસની ઉચ્ચ સપાટીના ચાર્જ ઘનતાને કારણે એન્ડોસોમલ મેમ્બ્રેનની અસ્થિરતાનો સમાવેશ થાય છે. PL અને chitosan પર આધારિત સંકુલો "પ્રોટોન સ્પોન્જ" અસરનું કારણ નથી અને એન્ડોસોમ મેમ્બ્રેનને અસ્થિર કરવામાં ઓછી સક્ષમ છે, જે ખૂબ ઓછી ટ્રાન્સફેક્શન કાર્યક્ષમતા તરફ દોરી જાય છે.

લાઇસોસોમ્સ છોડ્યા પછી, પોલીપ્લેક્સ પોતાને પેરીન્યુક્લિયર સ્પેસમાં શોધે છે, જે પછી જટિલ મુક્ત પોલિકેશન અને ડીએનએમાં અલગ પડે છે. એવું માનવામાં આવે છે કે ડીએનએના ફોસ્ફેટ જૂથો અને ઓછા પરમાણુ વજન સંયોજનો અને સાયટોપ્લાઝમના આયનોની વચ્ચેના કેશનિક જૂથો માટેની સ્પર્ધાને કારણે આવું થાય છે. કેટલાક કિસ્સાઓમાં, સંકુલનું વિયોજન દેખીતી રીતે ન્યુક્લિયસમાં થાય છે. સેલ ન્યુક્લિયસમાં પ્લાઝમિડ ડીએનએના માર્ગમાં મુખ્ય અવરોધ એ ડબલ પરમાણુ પરબિડીયું છે. ન્યુક્લિયસમાં મેક્રોમોલેક્યુલ્સ પહોંચાડવા માટે, તેમાં ન્યુક્લિયસ લોકલાઇઝેશન સિક્વન્સ (NLS)નો સમાવેશ થાય છે, જે α- અને β-importins સાથે મળીને, ન્યુક્લિયસ પોર કોમ્પ્લેક્સ (NPC) દ્વારા ઓળખવામાં આવશે અને સક્રિયપણે ન્યુક્લિયસમાં પ્રવેશ કરશે. નિષ્ક્રિય પ્રસાર દ્વારા માત્ર નાના અણુઓ NPCમાંથી પસાર થઈ શકે છે (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.

રોગનિવારક જનીનોની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિઓ

પ્લાઝમિડ ન્યુક્લિયસમાં પ્રવેશ્યા પછી, રોગનિવારક જનીનની અભિવ્યક્તિ શરૂ થાય છે. પોલિપ્લેક્સિસની ક્રિયાને વિશિષ્ટતા આપવા માટે, પ્લાઝમિડમાં રોગનિવારક જનીન પ્રમોટરના નિયંત્રણ હેઠળ મૂકવામાં આવે છે (જનીનનો વિસ્તાર કે જેના પર આરએનએ પોલિમરેઝ ટ્રાન્સક્રિપ્શન પહેલાં ઉતરે છે), જે ફક્ત ગાંઠની પેશીઓમાં જ સક્રિય હોય છે. ઉદાહરણોમાં એન્ટિ-એપોપ્ટોટિક પ્રોટીન સર્વાઇવિન માટે જનીનનો પ્રમોટર અથવા એન્ઝાઇમ ટેલોમેરેઝ માટે જનીનનો સમાવેશ થાય છે. હર્પીસ સિમ્પ્લેક્સ વાયરસ થાઇમિડિન કિનેઝ (HSVtk) જનીન, જે એન્ટિહર્પીસ સંયોજનો એસાયક્લોવીર અને ગેન્સીક્લોવીરને ફોસ્ફોરીલેટ કરવાની ક્ષમતા ધરાવે છે, તેનો ઉપચારાત્મક જનીન તરીકે ઉપયોગ કરી શકાય છે. આ સંયોજનો થોડા સમય પછી ગાંઠમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવે છે. આગળ, સેલ્યુલર કિનાસેસ (ફોસ્ફોરીલેટીંગ એન્ઝાઇમ્સ) ફોસ્ફોરીલેટેડ એસાયક્લોવીર અથવા ગેન્સીક્લોવીરને ટ્રાઇફોસ્ફેટ્સમાં રૂપાંતરિત કરે છે, જે કોષ વિભાજન દરમિયાન બમણા થવા દરમિયાન નવા સંશ્લેષિત ડીએનએમાં સમાવવામાં સક્ષમ છે અને તેના સંશ્લેષણને સમાપ્ત કરે છે. પરિણામે, કોષો કે જેમના ન્યુક્લીમાં થાઇમિડિન કિનેઝ જનીન દાખલ થયો છે તે આ પદાર્થોની હાજરીમાં નાશ પામે છે. આ કિસ્સામાં, તે વિભાજિત કોષો છે જે મૃત્યુ પામે છે, અને બાકીના કોષો નથી, જે ડીએનએનું સંશ્લેષણ કરતા નથી અને તેમાં ગેન્સીક્લોવીર અથવા એસાયક્લોવીરનો સમાવેશ થતો નથી. રોગનિવારક જનીનની ક્રિયાની આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કેન્સરની ગાંઠોની જનીન ઉપચાર માટે થઈ શકે છે જેમના કોષો ઝડપથી વિભાજીત થાય છે.

ગ્રંથસૂચિ:

1. ગોર્બુનોવા વી.એન., બરાનોવ વી.એસ. વારસાગત રોગોની મોલેક્યુલર ડાયગ્નોસ્ટિક્સ અને જનીન ઉપચારનો પરિચય. S.-Pb., "વિશેષ સાહિત્ય", 1997, p.287.
2. ડનલેપ ડી.ડી., મેગી એ., સોરિયા એમ.આર., મોનાકો એલ. જીન ડિલિવરી માટે કન્ડેન્સ્ડ ડીએનએનું નેનોસ્કોપિક માળખું. // ન્યુક્લ. એસિડ્સ. Res., 1997, વોલ્યુમ. 25, 3095–3101.
3. પાર્ક T.G., Jeong J.H., કિમ S.W. પોલિમેરિક જીન ડિલિવરી સિસ્ટમ્સની વર્તમાન સ્થિતિ. // એડવ. ડ્રગ ડેલિવ. રેવ., 2006, વોલ્યુમ. 58, 467–486.
4. પેક ડી.ડબલ્યુ., હોફમેન એ.એસ., પુન એસ. અને સ્ટેટોન પી.એસ. જીન ડિલિવરી માટે પોલિમરની ડિઝાઇન અને વિકાસ. // નેચર રેવ., ડ્રગ ડિસ્કવરી, 2005, વોલ્યુમ. 4,581 પર રાખવામાં આવી છે.
5. Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G.L. નોન-વાયરલ જીન ટ્રાન્સફર દરમિયાન પ્લાઝમિડ ડીએનએનું ઇન્ટ્રાસેલ્યુલર રૂટીંગ. // એડવ. ડ્રગ ડેલિવ. રેવ., 2005, વોલ્યુમ. 57, 755–767.
6. મેક્સફિલ્ડ એફ.આર. અને મેકગ્રા T.E. એન્ડોસાયટીક રિસાયક્લિંગ. // કુદરત રેવ. મોલ. કોષ. બાયોલ., 2004, વોલ્યુમ. 5, 121–132.
7. રીડ આર., એન્જી-ચુંગ એમ., એન્જી-ચાંગ એચ. અને ટોપલ એમ.ડી. હર્પીસવિરિડે, હ્યુમન આલ્ફા અને હ્યુમન બીટા પોલિમરેસીસ દ્વારા એસાયક્લિક, ડીડીઓક્સી અને એરા ન્યુક્લિયોટાઇડ્સનું નિવેશ અને વિસ્તરણ. // જે. બાયોલ. કેમ., 1988, વોલ્યુમ. 263, 3898–3904.

દુરીમાનવ મિખાઇલ, મોસ્કો સ્ટેટ યુનિવર્સિટીના બાયોલોજી ફેકલ્ટીના વિદ્યાર્થી

આ લેખ લોમોનોસોવ 2009 કોન્ફરન્સ (બાયોલોજી ફેકલ્ટી, વિભાગો “નેનોબાયોટેક્નોલોજી”, “બાયોએન્જિનિયરિંગ”, “બાયોફિઝિક્સ”માં લોકપ્રિય વિજ્ઞાન સ્પર્ધાનો ઇનામ-વિજેતા છે.

અસંખ્ય અભ્યાસો દર્શાવે છે તેમ, વિવિધ વાયરસનો ઉપયોગ એ ખૂબ જ અસરકારક ઉપાય છે, જે તમને શરીરના રોગપ્રતિકારક સંરક્ષણમાંથી પસાર થવા દે છે, અને પછી કોષોને ચેપ લગાડે છે, તેનો ઉપયોગ વાયરસ ફેલાવવા માટે કરે છે. આ પ્રક્રિયા હાથ ધરવા માટે, આનુવંશિક ઇજનેરોએ રેટ્રોવાયરસ અને એડેનોવાયરસના જૂથમાંથી સૌથી યોગ્ય વાયરસ પસંદ કર્યા. રેટ્રોવાયરસ રિબોન્યુક્લીક એસિડ (RNA) ના સ્વરૂપમાં આનુવંશિક માહિતી રજૂ કરે છે, જે ડીએનએ જેવું જ એક પરમાણુ છે જે ડીએનએમાં સંગ્રહિત આનુવંશિક માહિતીની પ્રક્રિયા કરવામાં મદદ કરે છે. જલદી કહેવાતા લક્ષ્ય કોષમાં ઊંડે પ્રવેશવું શક્ય છે, આરએનએ પરમાણુમાંથી ડીએનએ પરમાણુની નકલ મેળવવામાં આવે છે. આ પ્રક્રિયાને રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્શન કહેવામાં આવે છે.એકવાર નવા ડીએનએ પરમાણુ કોષ સાથે જોડાઈ ગયા પછી, કોષોની તમામ નવી નકલોમાં આ સંશોધિત જનીન હશે.

એડેનોવાયરસ આનુવંશિક માહિતી સીધી ડીએનએના સ્વરૂપમાં વહન કરે છે, જે બિન-વિભાજક કોષને પહોંચાડવામાં આવે છે. જોકે આ વાયરસ સીધા જ લક્ષ્ય કોષના ન્યુક્લિયસમાં ડીએનએ પહોંચાડે છે, ડીએનએ સેલના જીનોમ સાથે મેળ ખાતો નથી. આમ, સંશોધિત જનીન અને આનુવંશિક માહિતી પુત્રી કોશિકાઓમાં પસાર થતી નથી. એડેનોવાયરસનો ઉપયોગ કરીને હાથ ધરવામાં આવતી જનીન ઉપચારનો ફાયદો એ છે કે નર્વસ સિસ્ટમના કોષોમાં અને શ્વસન માર્ગના મ્યુકોસ મેમ્બ્રેનમાં ફરીથી વેક્ટર દ્વારા જનીનો દાખલ કરવું શક્ય છે. વધુમાં, જનીન ઉપચારની ત્રીજી પદ્ધતિ છે, જે કહેવાતા એડેનો-સંબંધિત વાયરસ દ્વારા હાથ ધરવામાં આવે છે. આ વાયરસ સમાવે છે આનુવંશિક માહિતી પ્રમાણમાં ઓછી માત્રામાં, અને રેટ્રોવાયરસ અને એડેનોવાયરસ કરતાં દૂર કરવું વધુ મુશ્કેલ છે. જો કે, એડિનો-સંબંધિત વાઈરસનો ફાયદો એ છે કે તેઓ માનવ રોગપ્રતિકારક તંત્રમાંથી કોઈ પ્રતિક્રિયા પેદા કરતા નથી.

એન્થ્રોપોજેનેટિક્સની વંશાવળી પદ્ધતિ

આ પદ્ધતિ વંશાવલિના સંકલન અને વિશ્લેષણ પર આધારિત છે. પ્રાચીન કાળથી લઈને આજ સુધી આ પદ્ધતિનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ ઘોડાના સંવર્ધનમાં, ઢોર અને ડુક્કરની કિંમતી રેખાઓની પસંદગીમાં, શુદ્ધ નસ્લના કૂતરા મેળવવામાં તેમજ ફર ધરાવતા પ્રાણીઓની નવી જાતિના સંવર્ધનમાં કરવામાં આવે છે.

માનવ આનુવંશિકતાના અભ્યાસની પદ્ધતિ તરીકે, વંશાવળી પદ્ધતિનો ઉપયોગ ફક્ત 20મી સદીની શરૂઆતથી જ થવા લાગ્યો, જ્યારે તે સ્પષ્ટ થઈ ગયું કે વંશાવલિનું વિશ્લેષણ, જે ચોક્કસ લક્ષણ (રોગ) ના પેઢીથી પેઢી સુધી ટ્રાન્સમિશનને શોધી કાઢે છે. વર્ણસંકર પદ્ધતિને બદલી શકે છે, જે ખરેખર મનુષ્યોને લાગુ પડતી નથી.

વંશાવલિનું સંકલન કરતી વખતે, પ્રારંભિક બિંદુ એ વ્યક્તિ છે - પ્રોબેન્ડ, જેની વંશાવલિનો અભ્યાસ કરવામાં આવી રહ્યો છે. સામાન્ય રીતે આ કાં તો દર્દી છે અથવા ચોક્કસ લક્ષણનો વાહક છે, જેનો વારસો અભ્યાસ કરવાની જરૂર છે. વંશાવલિ કોષ્ટકોનું સંકલન કરતી વખતે, જી. દ્વારા માત્ર 1931માં પ્રસ્તાવિત પ્રતીકોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે (ફિગ. 6.24). પેઢીઓને રોમન અંકો દ્વારા નિયુક્ત કરવામાં આવે છે, આપેલ પેઢીમાં વ્યક્તિઓને અરબી અંકો દ્વારા નિયુક્ત કરવામાં આવે છે.

વંશાવળી પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને, અભ્યાસ હેઠળના લક્ષણની વંશપરંપરાગત પ્રકૃતિ તેમજ તેના વારસાના પ્રકાર (ઓટોસોમલ ડોમિનેંટ, ઓટોસોમલ રીસેસીવ, એક્સ-લિંક્ડ ડોમિનેંટ અથવા રીસેસીવ, વાય-લિંક્ડ) સ્થાપિત કરી શકાય છે. જ્યારે વિવિધ લાક્ષણિકતાઓ માટે વંશાવલિનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે, ત્યારે તેમના વારસાની જોડાયેલી પ્રકૃતિ જાહેર કરી શકાય છે, જેનો ઉપયોગ રંગસૂત્રોના નકશાના સંકલનમાં થાય છે. આ પદ્ધતિ તમને પરિવર્તન પ્રક્રિયાની તીવ્રતાનો અભ્યાસ કરવા, એલીલની અભિવ્યક્તિ અને ઘૂંસપેંઠનું મૂલ્યાંકન કરવાની મંજૂરી આપે છે. સંતાનની આગાહી કરવા માટે તબીબી આનુવંશિક પરામર્શમાં તેનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે. જો કે, એ નોંધવું જોઇએ કે જ્યારે પરિવારોમાં થોડા બાળકો હોય ત્યારે વંશાવળી વિશ્લેષણ નોંધપાત્ર રીતે વધુ જટિલ બની જાય છે.

યુનિવર્સિટી ઓફ કેલિફોર્નિયા, ઇર્વિનના વૈજ્ઞાનિકો દ્વારા ડૉ. પીટર ડોનોવનના નિર્દેશનમાં અને ગર્ભના સ્ટેમ કોશિકાઓની હેરફેરની બે જાણીતી પદ્ધતિઓના સંયોજનના આધારે વિકસાવવામાં આવેલી આ ટેકનિક, માનવ ગર્ભના સ્ટેમ કોશિકાઓમાં DNA પહોંચાડવાની કાર્યક્ષમતાને બમણી કરે છે.

રાસાયણિક ટ્રાન્સફેક્શન, ન્યુક્લિયોફેક્શન અને ઇલેક્ટ્રોપોરેશનનો ઉપયોગ કરીને hESC માં DNA દાખલ કરવાની આધુનિક પદ્ધતિઓમાં ગંભીર ખામી છે - ઓછી કાર્યક્ષમતા. વાયરલ ચેપનો ઉપયોગ કરીને એચઈએસસીને આનુવંશિક સામગ્રીની ડિલિવરી વધુ અસરકારક છે, પરંતુ સ્ટેમ કોશિકાઓ માટે ઘણા અનિચ્છનીય પરિણામો ધરાવે છે અને જો કોષો વધુ પ્રત્યારોપણ માટે બનાવાયેલ હોય તો તબીબી દૃષ્ટિકોણથી સંપૂર્ણપણે સલામત કહી શકાય નહીં.

એક સ્ટેમ સેલના ન્યુક્લિયોફેક્શનના સંયોજન પર આધારિત નવી તકનીક અને પરિણામી ટ્રાન્સજેનિક વસાહતોને પસંદ કરવા માટેની ઑપ્ટિમાઇઝ પદ્ધતિ કોષોમાં ટ્રાન્સજેન્સની સમયસર અને સ્થિર અભિવ્યક્તિને સુનિશ્ચિત કરે છે. ન્યુક્લિયોફેક્શનમાં વિદ્યુત આવેગનો ઉપયોગ કરીને કોષ પટલમાં છિદ્રોની રચના અને કોષમાં ડીએનએના અનુગામી પરિચયનો સમાવેશ થાય છે.

રુચિના જનીન ઉપરાંત, સંશોધિત ડીએનએ રચના એક જનીન ધરાવે છે જે રૂપાંતરિત કોષને સરળ ટ્રેકિંગ કરવાની મંજૂરી આપે છે, ઉદાહરણ તરીકે, જનીન એન્કોડિંગ હ્યુમનાઇઝ્ડ રેનિલા ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (hrGFP). સેલ લેબલીંગની આ પદ્ધતિ રૂપાંતરિત કોષોની હિલચાલનું નિરીક્ષણ કરવાનું શક્ય બનાવે છે જ્યારે તેઓ પ્રાણીઓમાં ટ્રાન્સપ્લાન્ટ થાય છે.

સંભવિત રીતે, આ પદ્ધતિ બીમાર વ્યક્તિના તમામ કોષોમાં એક જનીનના પરિવર્તનને કારણે થતા મોનોજેનિક રોગોની સારવાર માટે ઉપયોગી થઈ શકે છે. વર્લ્ડ હેલ્થ ઓર્ગેનાઈઝેશન મુજબ, 10,000 થી વધુ માનવ રોગો પ્રકૃતિમાં મોનોજેનિક છે. વિશ્વભરમાં લાખો લોકો મોનોજેનિક રોગોથી પીડાય છે, જેમાં હંટીંગ્ટન રોગ, સિકલ સેલ એનિમિયા, હિમોફિલિયા અને સિસ્ટિક ફાઇબ્રોસિસનો સમાવેશ થાય છે.

નવી પદ્ધતિ HES કોશિકાઓની હેરફેરની શક્યતાઓને વિસ્તૃત કરશે, માનવ રોગોનું મોડેલ બનાવવા અને યોગ્ય દવાઓ શોધવાનું શક્ય બનાવશે. આ ટેકનીકનો ઉપયોગ કરીને વૈજ્ઞાનિકો સ્ટેમ સેલ્સમાં આનુવંશિક વિકૃતિઓને સુધારી શકશે અને પુનર્જીવિત દવામાં તંદુરસ્ત કોષોનો ઉપયોગ કરી શકશે.

લીલા ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન hrGFP વ્યક્ત કરતા HES કોષોની વસાહત.

Hohenstein KA et al દ્વારા લેખ. "ન્યુક્લિયોફેક્શન મધ્યસ્થી કરે છે ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા સ્થિર જીન નોકડાઉન અને માનવ ગર્ભના સ્ટેમ સેલ્સમાં ટ્રાન્સજીન અભિવ્યક્તિ" જર્નલના ઓન-લાઇન સંસ્કરણમાં ઉપલબ્ધ છે. સ્ટેમ સેલ 6 માર્ચ, 2008 થી.

જીએમઓ મેળવવા માટેની તમામ પદ્ધતિઓ પ્રત્યક્ષ (વેક્ટરલેસ) અને પરોક્ષ (વેક્ટર) માં વહેંચાયેલી છે.

ટ્રાન્સજેનિક પ્રાણીઓના ઉત્પાદન માટેની તમામ સીધી પદ્ધતિઓમાં સંખ્યાબંધ નોંધપાત્ર છે ખામીઓ: શ્રમની તીવ્રતા, ખર્ચાળ સાધનો અને રીએજન્ટ્સનો ઉપયોગ, રૂપાંતરિત પ્રાણીઓના કોષોના જીનોમમાં ડીએનએ પરમાણુઓનું વારંવાર નિવેશ, રૂપાંતર પછી મોટી સંખ્યામાં કોષો મૃત્યુ પામે છે, પરિચયિત ટ્રાન્સજીનનું મોઝેક.

નોંધપાત્ર ફાયદોસીધી પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ એ વિદેશી ડીએનએના સ્થાનાંતરણની એકદમ ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા છે, એટલે કે, પરોક્ષ પદ્ધતિઓ કરતાં ટ્રાન્સજીનને મોટી સંખ્યામાં કોષોમાં સ્થાનાંતરિત કરવું શક્ય છે.

વેક્ટર ડીએનએ, તેની રચના માટેની આવશ્યકતાઓ

વેક્ટર એ ડીએનએ અથવા આરએનએ પરમાણુ છે જેમાં બે ઘટકોનો સમાવેશ થાય છે: વેક્ટર ભાગ(વાહક) અને ક્લોન કરેલ વિદેશી જનીન. વેક્ટરનું કાર્ય પસંદ કરેલા ડીએનએને પ્રાપ્તકર્તા કોષ સુધી પહોંચાડવાનું, તેને જીનોમમાં એકીકૃત કરવાનું, રૂપાંતરિત કોષોને ઓળખવાની મંજૂરી આપવાનું અને પરિચયિત જનીનની સ્થિર અભિવ્યક્તિને સુનિશ્ચિત કરવાનું છે.

આમ, વેક્ટર નાનો હોવો જોઈએ, યજમાન કોષમાં જાળવવામાં સક્ષમ (પ્રતિકૃતિ), ઘણી વખત નકલ (એમ્પ્લીફાઈડ), અનુરૂપ જનીનને વ્યક્ત કરે છે (યોગ્ય નિયમનકારી ક્રમ ધરાવે છે), માર્કર જનીન હોવું જોઈએ જે વ્યક્તિ વચ્ચે તફાવત કરી શકે છે. તેમની અસરકારક પસંદગી માટે વર્ણસંકર કોષો; અનુરૂપ જીવતંત્રના કોષમાં સ્થાનાંતરિત થવા માટે સક્ષમ હોવા જોઈએ.

રસના જનીન સાથે, ધ માર્કર જનીનો, જીવતંત્રની ટ્રાન્સજેનિસિટી નક્કી કરવા માટે જરૂરી છે.

માર્કર જનીનોના બે જૂથોને અલગ કરી શકાય છે જે એકને રૂપાંતરિત કોષોને અલગ પાડવાની મંજૂરી આપે છે:

• 1. એન્ટિબાયોટિક્સ (કેનામિસિન, ટેટ્રાસાયક્લાઇન, નિયોમિસિન, વગેરે), હર્બિસાઇડ્સ (છોડમાં) સામે પ્રતિકાર માટે જવાબદાર પસંદગીયુક્ત જનીનો. આ અમુક સબસ્ટ્રેટ વગેરે માટે ઓક્સોટ્રોફી માટેના જનીનો હોઈ શકે છે. આવા માર્કરના સંચાલનનો મૂળભૂત સિદ્ધાંત એ છે કે રૂપાંતરિત કોષોની પસંદગીયુક્ત પોષક માધ્યમ પર વૃદ્ધિ કરવાની ક્ષમતા છે જેમાં અમુક પદાર્થો ઉમેરવામાં આવે છે જે બિન-રૂપાંતરિત, સામાન્ય કોષોના વિકાસ અને વિભાજનને અટકાવે છે.
• 2. કોષ-તટસ્થ પ્રોટીનનું એન્કોડિંગ રિપોર્ટર જનીન, જેની હાજરી પેશીઓમાં સરળતાથી ચકાસી શકાય છે.

પત્રકારો તરીકે મોટાભાગે ઉપયોગમાં લેવાતા જનીનો β-glucuronidase (GUS), ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન (GFP), લ્યુસિફેરેસ (LUC), અને ક્લોરામ્ફેનિકોલ એસિટિલટ્રાન્સફેરેઝ (CAT) છે. આજની તારીખે, આ શસ્ત્રાગારમાંથી સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા જનીનો GUS અને GFP છે અને થોડા અંશે, LUC અને CAT. હાલમાં રિપોર્ટર જનીન તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે, GUS એ 68 kDa β-glucuronidase એન્કોડિંગ Escherichia coli માંથી એક સંશોધિત જનીન છે. GUS પર્યાવરણીય પરિસ્થિતિઓની વિશાળ શ્રેણીમાં pH 5-8 અને 37°C પર શ્રેષ્ઠ સાથે સક્રિય છે. તે કુદરતી અને કૃત્રિમ ગ્લુકોરોનાઇડ્સની વિશાળ શ્રેણીને હાઇડ્રોલાઇઝ કરી શકે છે, જે એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિના સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિક અથવા ફ્લોરોમેટ્રિક નિર્ધારણ માટે તેમજ પેશીઓના હિસ્ટોકેમિકલ સ્ટેનિંગ (ઉદાહરણ તરીકે, વાદળી) માટે યોગ્ય સબસ્ટ્રેટની પસંદગીને મંજૂરી આપે છે. એન્ઝાઇમ એકદમ સ્થિર છે: તે ગરમી માટે પ્રતિરોધક છે (55°C પર અર્ધ જીવન લગભગ 2 કલાક છે) અને ડિટર્જન્ટની ક્રિયા માટે. ફ્રીઝ-થો પ્રક્રિયા દરમિયાન GUS પ્રવૃત્તિમાં કોઈ નુકસાન થતું નથી. આનુવંશિક ઇજનેરી પદ્ધતિઓ દ્વારા બનાવવામાં આવેલ કાઇમરિક પ્રોટીનમાં, GUS સામાન્ય રીતે તેની કાર્યાત્મક પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખે છે. જીવંત કોષોમાં, GUS પ્રોટીન પણ ઘણા કલાકોથી ઘણા દિવસો સુધી ખૂબ જ સ્થિર અને સક્રિય છે.

GFP (ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન - ગ્રીન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીન, અથવા ગ્રીન ફ્લોરોસેન્સ પ્રોટીન) શિમોમુરા એટ અલ દ્વારા શોધાયું હતું. 1962 માં લ્યુમિનેસન્ટ જેલીફિશ એક્વોરિયા વિક્ટોરિયામાં. GFP જનીનનું 1992 માં પ્રાશર એટ અલ. દ્વારા ક્લોનિંગ કરવામાં આવ્યું હતું, અને થોડા વર્ષોમાં આ જનીનનો રિપોર્ટર જનીન તરીકે સક્રિય ઉપયોગ વિવિધ પ્રો- અને યુકેરીયોટિક સજીવો સાથે કામમાં શરૂ થયો હતો. હાલમાં, GFP જનીનનો ઉપયોગ વિશ્વભરના સેંકડો અભ્યાસોમાં થાય છે, અને તેમની સંખ્યા ઝડપથી વધી રહી છે. આવી ઝડપી વૃદ્ધિ GFP પ્રોટીનના વિશેષ ગુણધર્મોને કારણે થાય છે, એટલે કે લાંબા-તરંગ યુવી સાથે ઇરેડિયેટ થાય ત્યારે સ્પેક્ટ્રમના દૃશ્યમાન (લીલા) પ્રદેશમાં ફ્લોરોસેસ કરવાની તેની ક્ષમતા. આ ફ્લોરોસેન્સ સીધા પ્રોટીન દ્વારા થાય છે અને તેના અભિવ્યક્તિ માટે સબસ્ટ્રેટ અથવા કોફેક્ટર્સની જરૂર નથી. આ ગુણધર્મ માટે આભાર, GFP જનીન ખૂબ જ આશાસ્પદ રિપોર્ટર જનીન છે, જે ટ્રાન્સજેનિક સજીવો સાથે વિવિધ પ્રકારના ઇન્ટ્રાવિટલ (બિન-વિનાશક) અભ્યાસ માટે પરવાનગી આપે છે.

દરિયાઈ એનિમોન ડિસ્કોસોમા એસપીમાંથી. અન્ય પ્રોટીન, DsRed, જે લાલ પ્રકાશમાં ફ્લોરોસેસ કરે છે, તેને તાજેતરમાં અલગ કરવામાં આવ્યું છે. રશિયન એકેડેમી ઓફ સાયન્સના વૈજ્ઞાનિકો દ્વારા તાજેતરમાં એન્થોઝોઆ ઓર્ડરના વિવિધ કોરલ પોલીપ્સમાંથી કેટલાક વધુ સમાન ફ્લોરોસન્ટ પ્રોટીનને અલગ કરવામાં આવ્યા છે. તે ખૂબ ઊંચા તાપમાન, આત્યંતિક pH મૂલ્યો અથવા મજબૂત ઘટાડતા એજન્ટો જેમ કે Na2SO4 દ્વારા વિકૃત કરી શકાય છે. જ્યારે શારીરિક પરિસ્થિતિઓમાં પરત આવે છે, ત્યારે GFP મોટે ભાગે તેની ફ્લોરોસેસ કરવાની ક્ષમતા પાછી મેળવે છે. આનુવંશિક ઇજનેરી પદ્ધતિઓ દ્વારા બનાવવામાં આવેલ કાઇમરિક પ્રોટીનમાં, GFP સામાન્ય રીતે તેની કાર્યાત્મક પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખે છે. જીવંત કોષોમાં, GFP પ્રોટીન પણ ખૂબ સ્થિર છે.

CAT જનીનો ક્લોરામ્ફેનિકોલ એસિટિલટ્રાન્સફેરેસ (એસ્ચેરીહિયા કોલીથી અલગ) ના સંશ્લેષણ માટે જવાબદાર છે. આ એન્ઝાઇમ એસિટિલ-કોએથી ક્લોરામ્ફેનિકોલમાં એસિટિલ જૂથના ટ્રાન્સફરને ઉત્પ્રેરિત કરે છે. તે યોગ્ય સબસ્ટ્રેટ ઉમેર્યા પછી પેશીઓના રંગમાં ફેરફાર દ્વારા હિસ્ટોકેમિકલ રીતે નક્કી કરવામાં આવે છે.

8860 0

હાલમાં, કોષોમાં રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ પહોંચાડવાની લગભગ 40 વિવિધ પદ્ધતિઓ જાણીતી છે, જે વિવિધ રીતે પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનને પાર કરવાની સમસ્યાને હલ કરે છે. કોષોમાં રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ પહોંચાડવા માટેની પદ્ધતિઓનું હજુ સુધી કોઈ એકીકૃત વર્ગીકરણ નથી. દરેક સમીક્ષા લેખક પોતપોતાની રીતે વર્ગીકૃત કરે છે, કદાચ કારણ કે ઘણી પ્રયોગમૂલક પદ્ધતિઓ માટે પટલ પર કાબુ મેળવવાની પદ્ધતિ હજુ પણ સ્પષ્ટ નથી, ઉદાહરણ તરીકે, પરિવર્તન માટે. પરિભાષા અંગે પણ અનિશ્ચિતતા છે, જે વિજ્ઞાન અને વ્યવહારના ઝડપથી વિકસતા નવા ક્ષેત્રમાં આશ્ચર્યજનક નથી.

કોષોમાં વિદેશી ડીએનએ પહોંચાડવાની દરેક પદ્ધતિની પોતાની લાક્ષણિકતાઓ, કોષના અસ્તિત્વ, વહીવટની કાર્યક્ષમતા, વર્સેટિલિટી અને તકનીકી અમલીકરણની શક્યતાઓના સંદર્ભમાં ફાયદા અને ગેરફાયદા છે. પદ્ધતિની પસંદગી યજમાન કોષોના પ્રકાર અને વપરાયેલ વેક્ટરના પ્રકાર તેમજ પ્રયોગકર્તાની વ્યક્તિગત પસંદગીઓ અને ક્ષમતાઓ પર આધારિત છે. લક્ષ્ય કોષોને ડીએનએ પહોંચાડવાની કેટલીક સૌથી જાણીતી પદ્ધતિઓ નીચે વિગતવાર ચર્ચા કરવામાં આવી છે.

તેના સૌથી સામાન્ય અર્થમાં પરિવર્તન એ કોષમાં મુક્ત DNA દાખલ કરવાની પ્રક્રિયા છે. સંકુચિત અર્થમાં, આ શબ્દ મુખ્યત્વે બેક્ટેરિયા માટે લાગુ પડે છે, જે કોષ પટલના તાપમાન તબક્કાના સંક્રમણ દ્વારા પ્રેરિત સક્ષમ કોષો દ્વારા પુનઃસંયોજક ડીએનએના શોષણની પ્રક્રિયાને સૂચવે છે. રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ સાથે કામ કરતી વખતે ઇ. કોલી એ સૌથી સામાન્ય જીવ છે, અને કોષોમાં પ્લાઝમિડ ડીએનએના પ્રવેશને સુનિશ્ચિત કરવા માટે, કોશિકાઓને CaCl2 અને DNAના બરફના ઠંડા દ્રાવણથી ઉકાળવામાં આવે છે અને પછી ~1 મિનિટ માટે 42°C પર ગરમીનો આંચકો આવે છે. .

દેખીતી રીતે, આવી સારવારના પરિણામે, સેલ દિવાલનો સ્થાનિક વિનાશ થાય છે. રૂપાંતરણ કાર્યક્ષમતા, જેને ઉમેરાયેલ DNA ના 1 μg દીઠ ટ્રાન્સફોર્મન્ટ્સની સંખ્યા તરીકે વ્યાખ્યાયિત કરવામાં આવે છે,
આ કિસ્સામાં તે આશરે 10,000 - 10,000,000 છે. આ પદ્ધતિની કાર્યક્ષમતા ઓછી છે, આશરે 0.1% કરતા ઓછા કોષો રૂપાંતરિત થાય છે, પરંતુ આ ગેરલાભને પસંદગી યોજનાઓના ઉપયોગ દ્વારા વળતર આપવામાં આવે છે જે ઇચ્છિત ક્લોન્સને ઝડપથી ઓળખવા દે છે.

કોષો જે વિદેશી ડીએનએને શોષી શકે છે તેને સક્ષમ કહેવામાં આવે છે. વસ્તીમાં આ કોષોનું પ્રમાણ સામાન્ય રીતે ખૂબ નાનું હોય છે, પરંતુ તેને વિશિષ્ટ પોષક માધ્યમ, સંસ્કૃતિની સ્થિતિ અને યોગ્યતાના રાસાયણિક પ્રેરકનો ઉપયોગ કરીને વધારી શકાય છે (પસંદ કરેલ, એક નિયમ તરીકે, પ્રયોગમૂલક). સક્ષમ કોશિકાઓની તૈયારીમાં વારંવાર ઉપયોગમાં લેવાતો તબક્કો એ સ્ફેરોપ્લાસ્ટ્સનું ઉત્પાદન છે - કોષો આંશિક રીતે અથવા સંપૂર્ણ રીતે (પ્રોટોપ્લાસ્ટ્સ) જેમાં બાહ્ય કઠોર કોષ દિવાલનો અભાવ હોય છે.

ઉદાહરણ તરીકે, બેસિલસ, લિસ્ટેરિયા, સ્ટ્રેપ્ટોમીસીસ, વગેરે જાતિના ઘણા ગ્રામ-પોઝિટિવ બેક્ટેરિયાને અસરકારક રીતે રૂપાંતરિત કરવાનો આ એકમાત્ર રસ્તો છે. કેટલીક યીસ્ટ ટ્રાન્સફોર્મેશન પદ્ધતિઓમાં ગ્લુકોસિડેસિસનો ઉપયોગ કરીને યીસ્ટ કોશિકાની દિવાલને ઉત્સેચક દૂર કરવાના તબક્કાઓનો પણ સમાવેશ થાય છે. યોગ્યતાના રાસાયણિક પ્રેરકો સામે પ્રતિરોધક અથવા કુદરતી ક્ષમતાનો અભાવ ધરાવતા સજીવો માટે, અન્ય ડીએનએ ડિલિવરી સિસ્ટમનો ઉપયોગ થાય છે.

જોડાણ. ત્યાં બેક્ટેરિયલ પ્લાઝમિડ્સ (સંયુક્ત પ્લાઝમિડ્સ) છે જે આંતરસેલ્યુલર સંપર્કો બનાવવાની ક્ષમતા ધરાવે છે, જેના દ્વારા તેઓ એક કોષમાંથી બીજા કોષમાં જાય છે. દાતા અને પ્રાપ્તકર્તા કોષો વચ્ચેના સંપર્કોની રચના પ્લાઝમિડ્સના સંયોજક ગુણધર્મો દ્વારા સુનિશ્ચિત થાય છે, અને DNA ટ્રાન્સફર પોતે જ ગતિશીલતા ગુણધર્મો દ્વારા સુનિશ્ચિત થાય છે. આ કિસ્સામાં, સંયોજક પ્લાઝમિડ તેની સાથે સમાન કોષમાં સ્થિત નિયમિત પ્લાઝમિડ વેક્ટર લઈ શકે છે.

આ રીતે, પ્રાપ્તકર્તા કોષોને રૂપાંતરિત કરવું શક્ય છે જે અન્ય માધ્યમો દ્વારા રૂપાંતરિત કરવું મુશ્કેલ છે. ઉદાહરણ તરીકે, શટલ વેક્ટર pAT187 નું ઇ. કોલીથી વિવિધ ગ્રામ-પોઝિટિવ બેક્ટેરિયા (જીનસ બેસિલસ, એન્ટરકોકસ, સ્ટેફાયલોકોકસ, વગેરે) માં યજમાનોની વિશાળ શ્રેણી સાથેનું ગતિશીલતા ટ્રાન્સફર દર્શાવવામાં આવ્યું છે, જોકે વચ્ચે ટ્રાન્સફર કરતાં ઘણી ઓછી કાર્યક્ષમતા સાથે. ઇ. કોલીની વિવિધ જાતો.

તદુપરાંત, બેક્ટેરિયલ કોષોમાંથી સંસ્કારી પ્રાણી કોષોમાં ડીએનએના સંયોજક ટ્રાન્સફરની શક્યતા તાજેતરમાં દર્શાવવામાં આવી છે. જોડાણ પ્રક્રિયા દરમિયાન, દાતા પ્લાઝમિડનો માત્ર એક સ્ટ્રાન્ડ સ્થાનાંતરિત થાય છે, જેના પર પછી બીજા સ્ટ્રાન્ડને સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. આના પરિણામે સંયોજક રીતે સ્થાનાંતરિત પ્લાઝમિડ પર યજમાન પ્રતિબંધ ઉત્સેચકો દ્વારા હુમલો કરવામાં આવતો નથી. બેક્ટેરિયા માટે આ પદ્ધતિની અસરકારકતા પરિવર્તન સાથે તુલનાત્મક છે.

વાયરલ ચેપ. વાયરસ-આધારિત વેક્ટર્સનો પરિચય આપવા માટે, યજમાન કોષના ચેપનો કુદરતી ચેપી માર્ગ, જે વાયરસના પ્રકાર પર આધાર રાખે છે, તેનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે.

છિદ્રીકરણ પદ્ધતિઓ. લક્ષ્ય કોષોમાં ન્યુક્લિયક એસિડનો પરિચય કરાવવા માટેની લોકપ્રિય પદ્ધતિઓમાંની એક ઇલેક્ટ્રોપોરેશન છે - ઇલેક્ટ્રિક ક્ષેત્રના સંક્ષિપ્ત પ્રભાવ હેઠળ બાયલેયર લિપિડ પટલમાં છિદ્રોની અસ્થાયી રચના. તે પરિવર્તનની સાર્વત્રિક ભૌતિક પદ્ધતિ છે, જેની તકનીક લગભગ તમામ પ્રકારના કોષો માટે વિકસાવવામાં આવી છે.

E. coli સાથે કામ કરતી વખતે, તૈયાર સેલ સસ્પેન્શન (~50 μl) અને DNA ઇલેક્ટ્રોડ્સ વચ્ચે મૂકવામાં આવે છે અને 1.8 kV ના વોલ્ટેજ પર ~4.5 ms સુધી ચાલતી સિંગલ વર્તમાન પલ્સ લાગુ કરવામાં આવે છે, ઇલેક્ટ્રોડ્સ વચ્ચેનું અંતર 1 mm છે. આવી સારવાર પછી, નાના પ્લાઝમિડ્સ (~3-6 kb) માટે રૂપાંતરણ કાર્યક્ષમતા વધીને 109-1011 અને મોટા (~135 kb) માટે 106 થઈ જાય છે. સમાન પરિસ્થિતિઓનો ઉપયોગ BAC વેક્ટરને E. coli માં દાખલ કરવા માટે થાય છે.

બાયલેયર લિપિડ મેમ્બ્રેન પર હાઈ-વોલ્ટેજ ડિસ્ચાર્જની ઈલેક્ટ્રોપોરેટિંગ અસર તેની વક્રતાની ત્રિજ્યા પર આધારિત હોવાનું જણાય છે. તેથી, નાના બેક્ટેરિયલ કોષો મોટા પ્રાણી અને છોડના કોષો કરતાં ઘણી વધુ ફીલ્ડ સ્ટ્રેન્થ (12-18 kV/cm) પર અસરકારક રીતે DNA શોષી લે છે, જે 1-2 kV/cm ની ફીલ્ડ સ્ટ્રેન્થ પર DNAને અસરકારક રીતે શોષી લે છે. ઇલેક્ટ્રોપોરેશન એ ડીએનએ અણુઓને કોષોમાં દાખલ કરવાની સૌથી સરળ, સૌથી અસરકારક અને પુનઃઉત્પાદનક્ષમ પદ્ધતિ છે, જેને, જોકે, ખાસ ઇલેક્ટ્રોપોરેટર ઉપકરણની જરૂર છે.

કોશિકાઓમાં ડીએનએ પહોંચાડવા માટેની અન્ય છિદ્રીકરણ પદ્ધતિઓ: કોષોનું અલ્ટ્રાસોનિકેશન, બાહ્ય સામગ્રીની હાજરીમાં સબસ્ટ્રેટમાંથી કોષોને સ્ક્રેપિંગ, ઇલેક્ટ્રોપોરેશન સાથે સંયોજનમાં ડીએનએ સાથેના માધ્યમમાં કોષોનું સેન્ટ્રીફ્યુગેશન, પ્લાઝ્મા મેમ્બ્રેનનું ઓસ્મોટિક છિદ્ર, લેસર સાથે કોષ ભંગાણ. માઇક્રોબીમ, છિદ્ર-રચના ઝેર સ્ટ્રેપ્ટોલિસિન-ઓ નો ઉપયોગ.

ટ્રાન્સફેક્શન. શરૂઆતમાં, આ શબ્દનો અર્થ કોશિકાઓમાં વાયરલ ડીએનએનો પરિચય હતો; હવે તેનો અર્થ યુકેરીયોટિક કોષોમાં કોઈપણ વિદેશી ડીએનએની રજૂઆત સુધી વિસ્તર્યો છે. "પરિવર્તન" શબ્દ, જે પ્રોકેરીયોટ્સ અને યીસ્ટ માટે કોષમાં ડીએનએ દાખલ કરવાની પ્રક્રિયાનો સંદર્ભ આપે છે, તે ઉપયોગમાં લેવા માટે અસુવિધાજનક હોવાનું બહાર આવ્યું છે, કારણ કે પ્રાણી કોષોના સંબંધમાં પરિવર્તન એ સામાન્ય કોષોનું કેન્સરગ્રસ્ત કોષોમાં રૂપાંતર છે. સંકુચિત અર્થમાં, ટ્રાન્સફેક્શન મુખ્યત્વે વિવિધ રાસાયણિક રીએજન્ટ્સનો ઉપયોગ કરીને યુકેરીયોટિક કોશિકાઓમાં ડીએનએની રજૂઆતનો સંદર્ભ આપે છે.

કાર્યક્ષમ ટ્રાન્સફેક્શન માટેની પ્રથમ પદ્ધતિઓમાંની એક DEAE-dextran સાથે ડીએનએનું સેવન હતું. પરિણામી કાર્યક્ષમતા બેક્ટેરિયલ રૂપાંતરણ સાથે તુલનાત્મક હતી અને ડીએનએના μg દીઠ 106 ટ્રાન્સફેક્ટન્ટ્સ સુધી પહોંચી હતી.

DEAE-dextran ની ક્રિયા કરવાની પદ્ધતિ સંપૂર્ણપણે સ્થાપિત થઈ નથી, પરંતુ તે જાણીતું છે કે તે ડીએનએ અને કોષ પટલ સાથે જોડાય છે, પિનોસાયટોસિસ (ફિગ. 2.8) ને ઉત્તેજિત કરે છે, જો કે તે કોષો દ્વારા લેવામાં આવતું નથી. પદ્ધતિના ગેરફાયદામાં કેટલાક પ્રકારના કોષો માટે DEAE-dextran ની ઝેરી અસર, દવાની ગુણવત્તા પર અસરકારકતાની અવલંબન અને સ્થિર ટ્રાન્સફેક્ટન્ટ્સ મેળવવાની ખૂબ ઓછી આવર્તનનો સમાવેશ થાય છે.

ચોખા. 2.8. એન્ડોસાયટોસિસ દ્વારા કોષમાં વિવિધ સંકુલના ભાગ રૂપે ડીએનએની રજૂઆતની યોજના: ફેગોસાયટોસિસ અને પિનોસાયટોસિસ (એ). બંધાયેલ ડીએનએ સાથે ડેન્ડ્રોફોર્મમાં બિન-લિપિડ પોલિકેશનના કણની યોજનાકીય રજૂઆત, જેનો નકારાત્મક ચાર્જ કેટેનિક પોલિમર (બી) દ્વારા વળતર આપવામાં આવે છે.

કેલ્શિયમ ફોસ્ફેટ-અવક્ષેપિત ડીએનએ સાથે કોષોને ઉકાળીને ટ્રાન્સફેક્શન કાર્યક્ષમતા 10-100 ગણી વધી હતી. કેલ્શિયમ ડીએનએ અવક્ષેપના ગાઢ કણો ફેગોસાયટોસિસ (ફિગ. 2.8) દ્વારા કોષ દ્વારા શોષાય છે, પરંતુ ઘૂસી ગયેલા અણુઓનો માત્ર એક નાનો ભાગ ન્યુક્લિયસ સુધી પહોંચે છે અને રંગસૂત્ર ડીએનએમાં એકીકૃત થાય છે. કેલ્શિયમ ફોસ્ફેટ પદ્ધતિ વધુ અસરકારક અને સસ્તી છે, પરંતુ ડીએનએ પરમાણુઓને તૂટવાનું કારણ બને છે, જે વર્તુળાકાર અણુઓને રેખીય સ્વરૂપમાં રૂપાંતરિત કરે છે, કેટલીકવાર વાયરલ ટ્રાન્સફેક્શનના કિસ્સામાં બિન-ચેપી હોય છે. વધુમાં, દરેક લક્ષ્ય કોષ માટે કેલ્શિયમ ફોસ્ફેટ ટ્રાન્સફેક્શન માટેની શરતો વ્યક્તિગત રીતે પસંદ કરવી આવશ્યક છે.

અન્ય ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ્સની શોધ દરમિયાન, એવું જાણવા મળ્યું હતું કે અધિક કેશનિક ચાર્જ વહન કરતા પોલિમર પરમાણુઓ ટ્રાન્સફેક્શન કાર્યક્ષમતામાં નોંધપાત્ર વધારો કરી શકે છે. પોલિમર કેશન્સ ન્યુક્લીક એસિડ સાથે તટસ્થ ચાર્જ સાથે સ્થિર સંકુલ બનાવે છે, જે ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા સાથે કોષમાં ડીએનએ અને આરએનએનું પરિવહન કરી શકે છે, તેમને ન્યુક્લિયસ (ફિગ. 2.9) તરફના માર્ગમાં એન્ડોન્યુક્લીઝની ક્રિયાથી રક્ષણ આપે છે.

ચોખા. 2. 9. લિગાન્ડ-મધ્યસ્થી એન્ડોસાયટોસિસ દ્વારા ચોક્કસ લિગાન્ડ સાથે બંધાયેલા પોલિકેશન-ડીએનએ સંકુલના ભાગરૂપે સેલ ન્યુક્લિયસમાં ડીએનએ પરિવહનની યોજના

કૃત્રિમ બિન-લિપિડ પોલિમર કેશન્સ લીનિયર અથવા બ્રાન્ચ્ડ કન્ફોર્મેશન (ડેંડ્રિટિક સ્વરૂપ) માં ડીએનએ અને આરએનએને પ્રમાણમાં નાના કણોમાં ઘટ્ટ કરી શકે છે, જે પછી કોશિકા કલા સાથે જોડાય છે અને બિન-વિશિષ્ટ એન્ડોસાયટોસિસ દ્વારા કોષમાં પ્રવેશ કરે છે. હાલમાં, નોન-લિપિડ પોલિકેશન્સ, પોલિઇથિલેનિમાઇન, પોલિમિડોમાઇન અને તેના પર આધારિત ડેન્ડ્રીમર્સના જૂથમાંથી ટ્રાન્સફેક્શન માટે, પોલિલિસિન, પ્રોટામાઇન અને હિસ્ટોન્સ જેવા કેશનિક પ્રોટીન તેમજ PAMAM જેવા વિવિધ વ્યાવસાયિક ઉત્પાદનોનો મુખ્યત્વે ઉપયોગ થાય છે.

ક્રાંતિ એ પ્રથમ ઓછા-ઝેરી કેશનિક લિપિડ DOTMA (1,2-dioleyl-3-N,N,N-ટ્રાઇમેથિલેમિનોપ્રોપેન) ની પ્રેક્ટિસમાં પરિચય હતો, જેનું સંશ્લેષણ Feigner (1987) એટ અલ. કેશનિક લિપિડ (ફિગ. 2.10) નો ઉપયોગ કરીને ટ્રાન્સફેક્શન કાર્યક્ષમતા સ્થિર ટ્રાન્સજેનિક કોષોના ઉચ્ચ પ્રમાણ સાથે, અન્ય કોઈપણ રાસાયણિક રીએજન્ટ કરતાં આશરે 100 ગણી વધારે હતી.

ચોખા. 2. 10. DNA (a) સાથે સંકુલનું માળખું અને cationic લિપિડ પોલિમર (b) ની સામાન્ય રચના. કેશનિક લિપિડ પોલિમર (રેખીય અને ડાળીઓવાળું), સેલ્યુલર મેમ્બ્રેન ફોસ્ફોલિપિડ્સની રચના અને ગુણધર્મોમાં સમાન, માત્ર રીએજન્ટ્સનું મિશ્રણ કરીને બહુસ્તરીય કેશનિક લિપોસોમ્સ (a) ના સ્વરૂપમાં DNA સાથે સંકુલ બનાવે છે. આવા સંકુલ લિપિડ ભાગ દ્વારા કોષ પટલ સાથે એન્ડોસાયટોસિસ અથવા ફ્યુઝન દ્વારા કોષમાં પ્રવેશ કરે છે.

તે જ સમયે, એક નવો શબ્દ "લિપોફેક્શન" વ્યવહારમાં રજૂ કરવામાં આવ્યો, જે કોષોના આનુવંશિક પરિવર્તનની ઉચ્ચ કાર્યક્ષમતા પર ભાર મૂકે છે, લિપિડ-કેશન સંકુલને ચેપી વાયરલ કણોની નજીક લાવે છે.

આ સફળતાના આધારે, આ સંયોજનોની અસંખ્ય ભિન્નતાઓ વિકસાવવામાં આવી હતી (લિપોફેક્ટીન, લિપોફેક્ટીન, સેલફેક્ટીન, વગેરે).

સમાંતર, ડીએનએ અથવા આરએનએથી ભરેલા ફોસ્ફોલિપિડ લિપોસોમ પર આધારિત ડિલિવરી વાહનો વિકસાવવામાં આવ્યા હતા.

કૃત્રિમ પટલના નાના ગોળા કોષના પ્લાઝ્મા પટલ સાથે ભળી શકે છે અથવા કોષમાં સમાવિષ્ટોને મુક્ત કરીને એન્ડોસાયટોસિસ દ્વારા લેવામાં આવે છે. લિપોસોમના બંધારણમાં ફોસ્ફોલિપિડ્સ દાખલ થવાથી લિપોસોમ ટ્રાન્સફેક્શનની નીચી કાર્યક્ષમતામાં વધારો થયો હતો, ઉદાહરણ તરીકે, કાર્ડિયોલિપિન અને ફોસ્ફેટિડાઇલેથેનોલામાઇન, જે, બાયલેયર મેમ્બ્રેન સાથે, ઊંધી માઇસેલર સ્ટ્રક્ચર્સ પણ બનાવે છે, જેને ક્યુબિક અને ષટ્કોણ તરીકે ઓળખવામાં આવે છે, મેમ્બ્રેનિંગ તબક્કામાં સક્ષમ છે. ફ્યુઝન

લિપોસોમ પદ્ધતિ તદ્દન તરંગી છે અને ચોક્કસ કોષોના અસરકારક ટ્રાન્સફેક્શન માટે તમામ શરતોની કાળજીપૂર્વક પસંદગીની જરૂર છે. વધુમાં, એન્કેપ્સ્યુલેશન પ્રક્રિયા, સામાન્ય રીતે સોનિકેશન, મોટાભાગે મોટા ડીએનએ પરમાણુઓને નુકસાન પહોંચાડે છે.

ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ્સના વિકાસમાં એક નવો તબક્કો મેમ્બ્રેન રીસેપ્ટર પ્રોટીન સાથે બંધન માટે સિન્થેટિક ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ્સ અને લિપોસોમ્સની રચનામાં વિવિધ લિગાન્ડ્સનો પરિચય કરીને ચોક્કસ લક્ષ્ય કોષોને ન્યુક્લિક એસિડની વધુ અસરકારક અને લક્ષિત વિતરણનો વિકાસ હતો. સેલ્યુલર રીસેપ્ટર્સ દ્વારા ઓળખાતા આવા લક્ષ્યાંક જૂથો (લિગાન્ડ્સ) ની હાજરી, લિગાન્ડ-મધ્યસ્થી એન્ડોસાયટોસિસ મિકેનિઝમ્સનો ઉપયોગ કરવાની મંજૂરી આપે છે (ફિગ 2.9 જુઓ).

રીસેપ્ટર્સ દ્વારા ઓળખાતા પ્રોટીન અને પેપ્ટાઈડ્સનો ઉપયોગ આવા લિગાન્ડ તરીકે થાય છે; ઓલિગોસેકરાઇડ્સ, કારણ કે ઘણા પ્રાણી કોષોની સપાટી પર લેક્ટિન્સ છે - રીસેપ્ટર પ્રોટીન જે તેમને ખાસ બાંધે છે; પોલિસેકરાઇડ્સ. આવા લક્ષિત DNA (RNA)-ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ કોમ્પ્લેક્સના કોષો સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની પ્રક્રિયાઓ કોષમાં વાયરલ કણોના પ્રવેશ જેવી જ હોય ​​છે.

હાલમાં, બાયોટેક્નોલોજી કંપનીઓ વિવિધ ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ્સની વિશાળ શ્રેણી ઓફર કરે છે - સૌથી સરળ અને સસ્તીથી લઈને નવીનતમ વિકાસ સુધી, વિવિધ સેલ પ્રકારો અને કાર્યો માટે વિશિષ્ટ. નવા, વધુ અસરકારક ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ્સનું નિર્માણ પણ સઘન રીતે ચાલુ છે.

માઇક્રોઇંજેક્શન - કોષ પટલને માઇક્રોનીડલ વડે વીંધવામાં આવે છે અને ડીએનએ ધરાવતું સોલ્યુશન કોષના સાયટોપ્લાઝમમાં અથવા સીધું ન્યુક્લિયસમાં ઇન્જેક્ટ કરવામાં આવે છે જો ન્યુક્લિયસ પૂરતું મોટું હોય (ઉદાહરણ તરીકે, ઇંડાનું ન્યુક્લિયસ). સસ્તન પ્રાણીઓના કોષોમાં ડીએનએનું માઇક્રોઇન્જેક્શન 0.1-0.5 μm વ્યાસ અને માઇક્રોમેનિપ્યુલેટર સાથે માઇક્રોપિપેટ્સ ઉત્પન્ન કરવા માટેના ઉપકરણના આગમન સાથે શક્ય બન્યું. પદ્ધતિ ખૂબ જ અસરકારક છે; ઇન્જેક્ટેડ જનીનોની સ્થિર એકીકરણ અને અભિવ્યક્તિ સાથે કોશિકાઓનું પ્રમાણ 50% સુધી પહોંચી શકે છે. વર્ણવેલ પદ્ધતિનો ફાયદો એ પણ છે કે તે તમને કોઈપણ કોષોમાં કોઈપણ ડીએનએ દાખલ કરવાની મંજૂરી આપે છે અને કોષોમાં દાખલ કરેલ જનીનને જાળવવા માટે કોઈ પસંદગીયુક્ત દબાણની જરૂર નથી.

બેલિસ્ટિક ટ્રાન્સફેક્શન, બાયોબેલિસ્ટિક્સ અથવા બાયોલિસ્ટિક્સ (માઈક્રોપાર્ટિકલ બોમ્બાર્ડમેન્ટ), ડીએનએ સાથે કોટેડ આશરે 1-2 માઇક્રોન કદના માઇક્રોસ્ફિયર્સ સાથે બોમ્બાર્ડિંગ કોષો પર આધારિત છે. સોનાના માઇક્રોપાર્ટિકલ્સ, ટંગસ્ટન (કેટલીકવાર ફાયટોટોક્સિક), સિલિકોન અને વિવિધ કૃત્રિમ નેનોસ્ફિયરનો ઉપયોગ થાય છે. ડીએનએ સાથે કોટેડ સૂક્ષ્મ કણો કોષના સ્તરોમાંથી પસાર થાય છે અને આનુવંશિક રચનાને સીધા જ ઓર્ગેનેલ્સ અને સેલ ન્યુક્લીમાં સ્થાનાંતરિત કરે છે. આ હેતુ માટે બનાવવામાં આવેલ “જીન ગન” અથવા “જીન ગન”, જે 1987 માં જે. સેનફોર્ડ દ્વારા ડીએનએને અનાજના અનાજમાં દાખલ કરવા માટે વિકસાવવામાં આવી હતી, તે એર ગન જેવી જ છે (ફિગ. 2.11).

ચોખા. 2.11. બાયો-રેડ (a) અને તેની સામાન્ય યોજના (b) માંથી ફરીથી વાપરી શકાય તેવી "જીન ગન" નો ઉપયોગ કરીને છોડના પાંદડાઓમાં પુનઃસંયોજક ડીએનએનો પરિચય. હિલીયમ પલ્સ સેમ્પલ કેપ્સ્યુલમાંથી ડીએનએ અથવા આરએનએ સાથે કોટેડ માઇક્રોપાર્ટિકલ્સને બહાર કાઢે છે. ડીએનએ વહન કરતા સૂક્ષ્મ કણો કોશિકાઓમાં મહત્તમ પ્રવેશ માટે પ્રવેગિત અને કેન્દ્રિત છે, પ્રવેગક ચેનલ સાથે અને બંદૂકના બેરલ સાથે આગળ વધે છે, જ્યારે વિશાળ આઉટલેટ પર હિલીયમ પ્રવાહ વિખરાયેલ બાજુઓ તરફ અલગ પડે છે. સ્પેસર ફિલ્ટર શ્રેષ્ઠ લક્ષ્ય જોડાણ અંતર જાળવી રાખે છે જ્યારે કોષની સપાટી પર નુકસાનકારક અસરોને ઘટાડવા માટે હિલીયમને મહત્તમ રીતે દૂર કરે છે.

માઇક્રોપાર્ટિકલ્સની ઘૂંસપેંઠ ઊંડાઈ, નિયમ પ્રમાણે, નાની છે - 1 મીમી સુધી, જો કે, ખાસ ફાયરિંગ પરિસ્થિતિઓમાં, માઇક્રોપાર્ટિકલ્સ 4-5 મીમીની ઊંડાઈ સુધી પેશીઓમાં પ્રવેશ કરી શકે છે અને જનીનોને સ્થાનાંતરિત કરી શકે છે, ઉદાહરણ તરીકે, સ્ટ્રાઇટેડ સ્નાયુઓના રેસામાં. . બેલિસ્ટિક ટ્રાન્સફેક્શન ખૂબ જ અસરકારક છે ત્યાં પણ જ્યાં જાડી કોષની દિવાલો (યીસ્ટ, છોડ) અન્ય ઘણી ડિલિવરી પદ્ધતિઓ માટે અવરોધ છે, અને તેનો ઉપયોગ પેશીઓ, અવયવો અને સમગ્ર સજીવો સહિત થાય છે. હાલમાં ટ્રાન્સજેનિક પ્રાણીઓ અને છોડના ઉત્પાદન માટે જનીન ઉપચારમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે.

ટ્રાન્સફેક્શન સાધનો અને પદ્ધતિઓની આ વિવિધતા વિવિધ કાર્યો, ઉપયોગમાં લેવાતા લક્ષ્ય કોષોની વિશાળ શ્રેણી અને કોષોને પહોંચાડવામાં આવતા ન્યુક્લિક એસિડના પ્રકારો તેમજ કોષો, પેશીઓ અને આનુવંશિક માહિતી પહોંચાડવાના વધુને વધુ અસરકારક માધ્યમો મેળવવા માટે સમાજની જરૂરિયાતોને કારણે છે. સમગ્ર જીવો. માનવ જનીન ઉપચારની અદ્ભુત સંભાવનાઓ સાથે જોડાણમાં ટ્રાન્સફેક્શન રીએજન્ટ્સ અને પદ્ધતિઓના વિકાસ પર ખાસ ધ્યાન આપવામાં આવે છે, જેને જનીન વિતરણના લક્ષ્યાંકિત, અત્યંત અસરકારક અને સલામત માધ્યમોની જરૂર છે.

કોષમાં વિદેશી ડીએનએનો સ્થિર અને ક્ષણિક પરિચય. યુકેરીયોટિક કોષમાં રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએની રજૂઆત પછી, તેનો માત્ર એક નાનો ભાગ ન્યુક્લિયસમાં સમાપ્ત થાય છે, કારણ કે પરમાણુ પટલ વિદેશી ડીએનએ માટે મુશ્કેલ અવરોધ છે. ન્યુક્લિયસમાં, રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ રંગસૂત્રમાં એકીકૃત થઈ શકે છે અથવા એક્સ્ટ્રા ક્રોમોસોમલ અવસ્થામાં અમુક સમય માટે અસ્તિત્વ ધરાવે છે.

તદનુસાર, સ્થિર ટ્રાન્સફેક્શન વચ્ચે તફાવત બનાવવામાં આવે છે, જ્યારે રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ પ્રાપ્તકર્તા કોશિકાઓના રંગસૂત્રોમાં એકીકૃત થાય છે અને તેમનો અભિન્ન ભાગ બની જાય છે, તેમજ અસ્થાયી અથવા ક્ષણિક ટ્રાન્સફેક્શન, જેમાં રિકોમ્બિનન્ટ ડીએનએ પરમાણુઓ અસ્તિત્વ ધરાવે છે અને ન્યુક્લીમાં ટ્રાન્સક્રિપ્ટ થાય છે. ટૂંકા સમય માટે એક્સ્ટ્રાક્રોમોસોમલ સ્થિતિ. પરિચયિત વિદેશી ડીએનએનો સ્થિર વારસો એ આર્થિક હેતુઓ માટે ટ્રાન્સજેનિક સજીવો મેળવવા માટેની મુખ્ય સ્થિતિ છે.

તેથી, કોષોમાં ડીએનએ દાખલ કરવા માટેની પદ્ધતિઓના વિકાસ પર વિશેષ ધ્યાન આપવામાં આવે છે જે સ્થિર ટ્રાન્સફોર્મન્ટ્સના મોટા પ્રમાણમાં ઉત્પાદન તરફ દોરી જાય છે. આ ઉપરાંત, સ્થિર ટ્રાન્સફોર્મન્ટ્સની મોટી ટકાવારી પણ પસંદગીયુક્ત અને માર્કર જનીનોને છોડી દેવાનું શક્ય બનાવે છે, જે ટ્રાન્સજેનિક સજીવોની રચનામાં ગલ્લા છે.

પર. વોઇનોવ, ટી.જી. વોલોવા