લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ પરીક્ષા- પ્રયોગશાળા રોગપ્રતિકારક પદ્ધતિએન્ટિજેન્સ અને એન્ટિબોડીઝનું ગુણાત્મક નિર્ધારણ અને જથ્થાત્મક માપન. ELISA ના ઘણા ડઝન ફેરફારો છે. સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતી ઘન-તબક્કાની વિજાતીય ઇમ્યુનોએસે ELISA (એન્ઝાઇમ લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે) છે.

એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA) પદ્ધતિ એન્ટિજેન અને તેના અનુરૂપ એન્ટિબોડી વચ્ચેની ચોક્કસ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના સિદ્ધાંત પર આધારિત છે. રચિત સંકુલની ઓળખ કહેવાતા સંયોજકનો ઉપયોગ કરીને હાથ ધરવામાં આવે છે, જે એન્ઝાઇમ લેબલ સાથે જોડાયેલ એન્ટિ-એન્ટિબોડી છે (સામાન્ય રીતે હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ અથવા અન્ય પેરોક્સિડેઝનો ઉપયોગ થાય છે).

પોલીક્લોનલ એન્ટિ-પ્રજાતિ એન્ટિબોડીઝ (દા.ત., સસલા વિરોધી માનવ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન એન્ટિબોડીઝ) અથવા મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝવિરુદ્ધ નિર્દેશિત માનવ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિનચોક્કસ વર્ગ (M, G, A).

કયા એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે તેના આધારે, પરીક્ષણ પદ્ધતિ પરીક્ષણ નમૂનામાં ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝને શોધી કાઢશે, તેમના વર્ગને ધ્યાનમાં લીધા વિના, અથવા માત્ર ચોક્કસ વર્ગના એન્ટિબોડીઝ (ઉદાહરણ તરીકે, માત્ર ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન જી અથવા ફક્ત ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન M).

એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે પદ્ધતિઓ.એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે (અથવા ઇમ્યુનોકેમિકલ) પૃથ્થકરણમાં પ્રાથમિક પ્રક્રિયા એ વિશિષ્ટ એન્ટિબોડી દ્વારા વિશ્લેષણ કરાયેલ સંયોજનની "ઓળખ" નો તબક્કો છે. કારણ કે ઇમ્યુનોકેમિકલ સંકુલની રચનાની પ્રક્રિયા સખત જથ્થાત્મક ગુણોત્તરમાં થાય છે, જે જોડાણ, ઘટકોની સાંદ્રતા અને પ્રતિક્રિયાની પરિસ્થિતિઓ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે, તે વિશ્લેષણ કરેલ સંયોજનની પ્રારંભિક સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે પૂરતું છે. પ્રમાણીકરણરોગપ્રતિકારક સંકુલની રચના. આવા મૂલ્યાંકન માટે, કાં તો રચાયેલા ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સ (પ્રકાર 1) ની સાંદ્રતા સીધી રીતે નક્કી કરવી અથવા બાકીની મફત વિશિષ્ટ બંધનકર્તા સાઇટ્સ (પ્રકાર 2) ની માત્રા નક્કી કરવી શક્ય છે. બીજું સામાન્ય તબક્કોએન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેની કોઈપણ પદ્ધતિ એ એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા સંયોજન અને ચોક્કસ જટિલ અથવા મુક્ત બંધન કેન્દ્રો વચ્ચેના બોન્ડની રચના છે. અને અંતે, એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેમાં અંતિમ ફરજિયાત પ્રક્રિયા એ એન્ઝાઇમ લેબલનું અનુરૂપ સિગ્નલમાં રૂપાંતર છે, જે અમુક ભૌતિક રાસાયણિક પદ્ધતિ (સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિક, ફ્લોરીમેટ્રિક, લ્યુમિનેસેન્ટ, વગેરે) દ્વારા માપવામાં આવે છે, જે રૂપાંતરણના દરને માપવા દ્વારા પ્રાપ્ત થાય છે. સબસ્ટ્રેટ અથવા ચોક્કસ સમયગાળા માટે રચાયેલ ઉત્પાદનનો જથ્થો.

વિશિષ્ટ સંકુલો નક્કી કરવા માટે ઉપરોક્ત વર્ણવેલ અભિગમોને ધ્યાનમાં લેતા, એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે પદ્ધતિઓનું વધુ વર્ગીકરણ વિશ્લેષણના પ્રથમ તબક્કામાં ઉપયોગમાં લેવાતા રીએજન્ટના પ્રકાર અનુસાર હાથ ધરવામાં આવી શકે છે. જો પ્રથમ તબક્કે માત્ર વિશ્લેષણ કરેલ સંયોજન અને તેના અનુરૂપ બંધન કેન્દ્રો (એન્ટિજેન અને ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝ) સિસ્ટમમાં હાજર હોય, તો પદ્ધતિ બિન-સ્પર્ધાત્મક છે. પ્રકાર 1 બિન-સ્પર્ધાત્મક પરીક્ષા માટે, ઘટકોનો શ્રેષ્ઠ ગુણોત્તર એ છે કે જેમાં બંધનકર્તા સ્થળોની સાંદ્રતા નિર્ધારિત સંયોજનની સાંદ્રતા કરતાં નોંધપાત્ર રીતે વધી જાય છે. આવશ્યક શરતબિન-સ્પર્ધાત્મક વિશ્લેષણ માટે પ્રકાર 2 એ વિશ્લેષક સંયોજન (એન્ટિજેન) અને ચોક્કસ બંધનકર્તા સાઇટ્સના વધારાના અથવા તુલનાત્મક સાંદ્રતાના ગુણોત્તરનું પાલન કરવાનું છે, કારણ કે આ કિસ્સામાં તફાવત નક્કી કરવામાં આવે છે. કુલ સંખ્યાબંધનકર્તા સાઇટ્સ અને રચાયેલી રોગપ્રતિકારક સંકુલની સંખ્યા. જો, વિશ્લેષણના પ્રથમ તબક્કે, સિસ્ટમમાં એકસાથે વિશ્લેષક અને તેના એનાલોગ (એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા વિશ્લેષક અથવા નક્કર તબક્કા પર સ્થિર વિશ્લેષક) સમાવિષ્ટ હોય, તો ચોક્કસ બંધન કેન્દ્રો માટે સ્પર્ધા કરે છે જે સંબંધિત ઉણપમાં છે, તો પદ્ધતિ સ્પર્ધાત્મક સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિ માટે આવશ્યક શરત એ વિશ્લેષણ કરેલ સંયોજન અને તેના એનાલોગની કુલ સાંદ્રતાના સંબંધમાં ચોક્કસ બંધનકર્તા સાઇટ્સની અભાવ છે.

એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે પદ્ધતિઓના વર્ગીકરણનો આગળનો સિદ્ધાંત એ દરેક ઇમ્યુનોકેમિકલ તબક્કામાં થતી પ્રતિક્રિયાઓના પ્રકાર અનુસાર તેનું વિભાજન છે. આને અનુરૂપ, બધી પદ્ધતિઓને બે જૂથોમાં વહેંચી શકાય છે - સજાતીય અને વિજાતીય.

એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેની વિજાતીય પદ્ધતિઓ.વિજાતીય એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે એ પદ્ધતિઓને જોડે છે જેમાં વિશ્લેષણ બે-તબક્કાની સિસ્ટમમાં હાથ ધરવામાં આવે છે, અને તબક્કાનું વિભાજન નિર્ધારણના કોઈપણ તબક્કે થઈ શકે છે. વર્ગીકરણની સગવડતા માટે, "ઓળખાણ" ના પ્રથમ તબક્કાની પ્રકૃતિ અનુસાર વિજાતીય પદ્ધતિઓને અલગ કરવાની સલાહ આપવામાં આવે છે, જે સમગ્ર વિશ્લેષણ માટે નિર્ણાયક છે. જો પ્રથમ તબક્કે એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ સ્થિર સ્થિતિમાં થાય છે અને ચોક્કસ ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સની રચના ઘન તબક્કા પર થાય છે, તો પદ્ધતિને નક્કર તબક્કાની તપાસ તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે. જો, વિશ્લેષણના પ્રથમ તબક્કે, વિશિષ્ટ રોગપ્રતિકારક સંકુલની રચના સોલ્યુશનમાં થાય છે, અને માત્ર ત્યારે જ સ્થાવર રીએજન્ટ સાથેનો નક્કર તબક્કો વિભાજન હેતુઓ માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે, તો પછી આવી પદ્ધતિઓને સજાતીય-વિજાતીય તરીકે વર્ગીકૃત કરવાની સલાહ આપવામાં આવે છે.

વિજાતીય એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે પદ્ધતિઓની વિવિધતા, પ્રકાર 1 અને 2 થી સંબંધિત છે, જે એન્ટિજેન પરમાણુ અને એન્ટિબોડી પરમાણુ બંનેમાં એન્ઝાઇમ લેબલ દાખલ કરવાની સંભાવનાને કારણે છે. વધુમાં, ચોક્કસ પૃથ્થકરણ યોજના માટે, તે નિર્ણાયક છે કે કયા રીએજન્ટ્સ - એન્ટિબોડી અથવા એન્ટિજેન - ઇમ્યુનોકેમિકલ સંકુલને અનબાઉન્ડ ઘટકોથી અલગ કરવા માટે સ્થિર સ્વરૂપમાં ઉપયોગમાં લેવાય છે.

એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે કરવાની વિજાતીય બિન-સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિના ઉદાહરણ તરીકે, અમે વિવિધ એન્ટિજેનિક વિશિષ્ટતાના એન્ટિબોડીઝની જોડીના ઉપયોગના આધારે પ્રોટીન (પોલીવેલેન્ટ એન્ટિજેન્સ) ના એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે માટે સૌથી સામાન્ય યોજનાઓમાંની એક રજૂ કરીએ છીએ, જેમાંથી એક નક્કર વાહકની સપાટી પર સ્થિર છે, અને બીજું એન્ઝાઇમ લેબલ (ઉદાહરણ તરીકે, horseradish peroxidase) સાથે જોડાયેલું છે. વિશ્લેષણ હાથ ધરવામાં આવે છે નીચેની રીતે. પરીક્ષણ નમૂનાને સોર્બ્ડ એન્ટિબોડીઝ સાથે પોલિસ્ટરીન પ્લેટના કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે અને 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે, જે દરમિયાન વિશ્લેષણ કરાયેલ એન્ટિજેન એન્ટિબોડીઝ સાથે પ્રતિક્રિયા આપે છે અને કુવાઓની સપાટી પર ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સ બનાવે છે. પ્લેટને અનબાઉન્ડ ઘટકોમાંથી ધોવામાં આવે છે અને એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝ ઉમેરવામાં આવે છે. સેકન્ડરી ઇન્ક્યુબેશન અને વધારાના એન્ટિબોડી-એન્ઝાઇમ કન્જુગેટને દૂર કર્યા પછી, વાહકની એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ નક્કી કરવામાં આવે છે, જે અભ્યાસ હેઠળ એન્ટિજેનની પ્રારંભિક સાંદ્રતાના પ્રમાણસર છે. ચોક્કસ ઇમ્યુનોકોમ્પ્લેક્સને ઓળખવાના તબક્કે, એન્ટિજેન સ્થિર અને લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝના પરમાણુઓ વચ્ચે સેન્ડવીચ થયેલું દેખાય છે, જેણે "સેન્ડવીચ" પદ્ધતિના સાહિત્યમાં વ્યાપક ઉપયોગને જન્મ આપ્યો. સાહિત્યમાં વારંવાર જોવા મળતું બીજું નામ બે-સાઇટ એસે છે. આ યોજનાનો ઉપયોગ ફક્ત તે જ એન્ટિજેન્સનું વિશ્લેષણ કરવા માટે થઈ શકે છે જેની સપાટી પર ત્યાં છે ઓછામાં ઓછુંબે એન્ટિજેનિક નિર્ધારકો એકબીજાથી દૂર સ્થિત છે, અને નક્કી કરવા માટે મોટી સંખ્યામાંમોનોવેલેન્ટ એન્ટિજેન્સ (ઉદાહરણ તરીકે, ઓછા પરમાણુ વજનવાળા હોર્મોન્સ, ઔષધીય સંયોજનો, જંતુનાશકો) પદ્ધતિ અસ્વીકાર્ય છે.

નીચા-મોલેક્યુલર-વજન એન્ટિજેન્સનું સ્પર્ધાત્મક ઘન-તબક્કાનું વિશ્લેષણ નીચેની યોજના અનુસાર અમલમાં મૂકી શકાય છે. એન્ટિજેન ધરાવતું સોલ્યુશન વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે અને એન્ટિજેન-એન્ઝાઇમ કન્જુગેટની નિશ્ચિત સાંદ્રતા વાહક પર સ્થિર એન્ટિબોડીઝમાં ઉમેરવામાં આવે છે. ઇન્ક્યુબેશન પછી, વાહકને અનબાઉન્ડ ફ્રી અને લેબલવાળા એન્ટિજેનથી ધોવાઇ જાય છે અને વાહક પર એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ નોંધવામાં આવે છે, જે એન્ટિજેનની સાંદ્રતાના વિપરિત પ્રમાણસર હોય છે.

સ્પર્ધાત્મક ટ્વીન-ફેઝ પદ્ધતિઓ બિન-સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિઓ કરતાં ઓછી સંવેદનશીલ હોય છે. તેમના માટે વિવિધ સંયોજનોની તપાસ મર્યાદા એન્ઝાઇમ લેબલની નોંધણીની સંવેદનશીલતા અને એન્ટિબોડીઝની સંલગ્નતા બંને દ્વારા મર્યાદિત છે, જ્યારે બિન-સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિઓ માટે, બિન-વિશિષ્ટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓની ગેરહાજરીમાં, તે માત્ર એન્ઝાઇમ નિર્ધારણની સંવેદનશીલતા દ્વારા જ છે. તેથી, સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા હાંસલ કરવા માટે, ઉચ્ચ-એફિનિટી એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરવો જરૂરી છે.

સજાતીય એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે પદ્ધતિઓ. સજાતીય પદ્ધતિઓમાં તે શામેલ છે જે સિંગલ-ફેઝ સિસ્ટમમાં હાથ ધરવામાં આવે છે અને તેને રચાયેલા સંકુલના યાંત્રિક વિભાજનના તબક્કાની જરૂર નથી. સજાતીય એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે હાથ ધરવા માટેની તમામ યોજનાઓમાં, ચોક્કસ એન્ટિબોડી-એન્ટિજેન સંકુલને બદલે મુક્ત બાકી રહેલા ચોક્કસ બંધન કેન્દ્રોની સાંદ્રતા નોંધવામાં આવે છે. જો કે, વિજાતીય પેટર્નથી વિપરીત, એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ પર લિગાન્ડ બંધનકર્તાની અસરની વિવિધ પ્રકૃતિને કારણે, બિન-કબજા વગરના ચોક્કસ બંધનકર્તા સ્થળોની સાંદ્રતાને અનુરૂપ અવલોકન કરાયેલ એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ કાં તો ઘટાડી અથવા વધારી શકે છે. એન્ટિજેન પરમાણુમાં લેબલનો પરિચય એ સજાતીય એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે પદ્ધતિઓમાં સૌથી સામાન્ય અભિગમોમાંનો એક છે. તમામ સજાતીય પદ્ધતિઓ સ્પર્ધાત્મક છે અને તે એન્ટિબોડીઝ સાથે વિશ્લેષણ અને લેબલ થયેલ એન્ટિજેન્સની એક સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પર આધારિત છે. સોલ્યુશનમાં અનુરૂપ ઇમ્યુનોકેમિકલ કોમ્પ્લેક્સની રચના પછી, એક માપ હાથ ધરવામાં આવે છે એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ, જે ફ્રી અથવા બાઉન્ડ લેબલવાળા લિગાન્ડની સાંદ્રતાના પ્રમાણસર છે.

એન્ટિબોડીઝ સાથેના સંકુલની રચના દરમિયાન એન્ઝાઇમ-એન્ટિજન કન્જુગેટમાં એન્ઝાઇમ ટેગની પ્રવૃત્તિમાં ફેરફારના આધારે EMIT વિશ્લેષણ (એન્ઝાઇમ ગુણાકાર ઇમ્યુનોસે ટેકનિક) એ સામાન્ય પદ્ધતિઓમાંની એક છે, જે રચનાત્મક પુનઃ ગોઠવણીના પરિણામે થાય છે. એન્ઝાઇમ પરમાણુ અથવા એન્ટિબોડીઝ સાથે જોડાણની જટિલ રચના દરમિયાન એન્ઝાઇમના સક્રિય કેન્દ્રમાં સબસ્ટ્રેટ પરમાણુની સુલભતાનો સ્ટીરિક બાકાત. એકરૂપ પદ્ધતિઓના ફાયદા એ વિશ્લેષણના સમય (કેટલીક મિનિટો) માં નોંધપાત્ર ઘટાડો છે; ગેરફાયદા એ ઓછી સંવેદનશીલતા અને વિશ્લેષણ પરિણામોને પ્રભાવિત કરતી વિશ્લેષણ નમૂનાની રચનાની શક્યતા છે.

પ્રતિક્રિયા કરવા માટે ઘણી પદ્ધતિઓ છે, પરંતુ હાલમાં નીચેની યોજનાનો ઉપયોગ ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝ (કહેવાતા સેન્ડવીચ ELISA પદ્ધતિ) શોધવા માટે થાય છે:

પેથોજેન એન્ટિજેન ટેસ્ટ પ્લેટના કુવાઓ પર નિશ્ચિત છે, જે ટેસ્ટ સીરમ અથવા રક્ત પ્લાઝ્મા સાથે ઉકાળવામાં આવે છે. જો તેમાં ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝ હોય, તો તેઓ એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી કોમ્પ્લેક્સ બનાવવા માટે જોડાય છે.

ત્યારબાદ, જ્યારે આ કોમ્પ્લેક્સ સંયોજક સાથે ઉકાળવામાં આવે છે, ત્યારે એન્ટિ-એન્ટિબોડીઝ હાલના એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી સંકુલ સાથે જોડાયેલા હોય છે. એન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયા (રંગ પ્રતિક્રિયા) હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ અને સબસ્ટ્રેટની હાજરીમાં થાય છે, જે રંગ વગરના સંયોજન દ્વારા રજૂ થાય છે, જે રંગીન પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનની પેરોક્સિડેઝ પ્રતિક્રિયા દરમિયાન ઓક્સિડાઇઝ થાય છે. અંતિમ તબક્કોસંશોધન હાથ ધરે છે. સ્ટેનિંગની તીવ્રતા ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝની માત્રા પર આધાર રાખે છે.

પરિણામનું મૂલ્યાંકન સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિક અથવા દૃષ્ટિની રીતે કરવામાં આવે છે. આ સિદ્ધાંતનો ઉપયોગ કરીને એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ ડાયગ્નોસ્ટિક્સ માટે મોટી સંખ્યામાં પરીક્ષણ પ્રણાલીઓ બનાવવામાં આવી છે. વિવિધ ચેપ: HIV ચેપ, વાયરલ હેપેટાઇટિસ, સાયટોમેગાલોવાયરસ, હર્પીસ, ટોક્સોપ્લાઝ્મા અને અન્ય ચેપ.

સેરોડાયગ્નોસિસ માટે, કોશિકાઓની દિવાલો પર 96-વેલ પોલિસ્ટરીન પ્લેટોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, જેમાં એન્ટિજેન પૂર્વ-શોષિત હોય છે. ટેસ્ટ સીરમ ટેબ્લેટના કોષમાં ઉમેરવામાં આવે છે. આ કિસ્સામાં, એન્ટિજેન સાથે હોમોલોગસ એન્ટિબોડીઝ તેની સાથે જોડાયેલા છે. બિનજોડાણયુક્ત એન્ટિબોડીઝ ધોવાથી દૂર કરવામાં આવે છે. આગળ, એન્ઝાઇમ સાથે લેબલ કરાયેલ માનવ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન (એન્ટિબોડીઝ) સામે એન્ટિબોડીઝ કોશિકાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે. જો પરીક્ષણ સીરમમાં શોધી શકાય તેવા એન્ટિબોડીઝ હાજર હતા, તો આ તબક્કે તેઓ એન્ટિજેન્સ તરીકે કાર્ય કરશે જેની સાથે લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝ પ્રતિક્રિયા કરશે. ધોવા પછી ક્રોમોજેનિક પદાર્થ (રંગ) ઉમેરવાથી અમને કોષોમાં વિકાસશીલ રંગની પ્રતિક્રિયા ધ્યાનમાં લેવામાં આવશે. રંગની તીવ્રતા એન્ઝાઇમની માત્રાના પ્રમાણમાં છે, અને તેથી એન્ટિબોડીઝની માત્રા. કોષમાં પ્રવાહીની ઓપ્ટિકલ ડેન્સિટી (OD) ને માપવા અને તેને નિયંત્રણ નમૂના સાથે સરખાવીને, વોલ્યુમના એકમોમાં એન્ટિબોડીઝની સાંદ્રતાની ગણતરી કરવામાં આવે છે. સૌથી સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ એ છે કે ઓપ્ટિકલ ડેન્સિટીના એકમોમાં પરિણામોની ગણતરી કરવી. તે ધ્યાનમાં લેવું આવશ્યક છે કે પરિણામોને રેકોર્ડ કરવા માટે દરેક પરીક્ષણ સિસ્ટમમાં તેના પોતાના સૂચકાંકો હોય છે અને સામાન્યતા અને પેથોલોજીના સૂચકાંકો હોય છે જે પરિણામોનું અર્થઘટન કરતી વખતે માર્ગદર્શન આપવું જોઈએ.

જો કે, એ નોંધવું જોઇએ કે એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે પણ પ્રદાન કરી શકે છે ખોટા પરિણામો. ખોટા હકારાત્મક કારણે થઇ શકે છે રુમેટોઇડ પરિબળ, જે માનવ પોતાના ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન જી સામે ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન M છે; વિવિધ દરમિયાન રચાયેલી એન્ટિબોડીઝને કારણે પ્રણાલીગત રોગો, મેટાબોલિક અથવા રિસેપ્શન ડિસઓર્ડર દવાઓ; નવજાત શિશુમાં, આવી ખોટી-સકારાત્મક પ્રતિક્રિયાઓ બાળકના શરીરમાં માતાના ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન જી માટે એમ-એન્ટિબોડીઝની રચનાને કારણે થઈ શકે છે. ખોટા-નકારાત્મક પ્રતિક્રિયા પરિણામો ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન એમ અને જી વચ્ચેની સ્પર્ધાને કારણે છે, તેમજ પ્રતિક્રિયામાં તકનીકી ભૂલો છે.

કયા એન્ટિજેન્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે તેના આધારે, એન્ટિબોડીઝ શોધવા માટેની તમામ એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે ટેસ્ટ સિસ્ટમને આમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે:

1. લિસેટ - જેમાં મૂળ એન્ટિજેન્સનું મિશ્રણ વપરાય છે (એક lysed અથવા અલ્ટ્રાસાઉન્ડ દ્વારા સારવાર કરાયેલ ચેપી એજન્ટ સંસ્કૃતિમાં પ્રાપ્ત થાય છે);

2. રિકોમ્બિનન્ટ - જેમાં આનુવંશિક ઇજનેરી દ્વારા મેળવેલા પ્રોટીનનો ઉપયોગ થાય છે જે પેથોજેનના ચોક્કસ પ્રોટીન એન્ટિજેન્સના એનાલોગ હોય છે;

3. પેપ્ટાઈડ - રાસાયણિક રીતે સંશ્લેષિત પ્રોટીન ટુકડાઓનો ઉપયોગ કરીને.

ELISA ડાયગ્નોસ્ટિક્સના વિકાસની સામાન્ય દિશા એ lysate પરીક્ષણ પ્રણાલીઓમાંથી દિશા છે, જેને સામાન્ય રીતે પ્રથમ પેઢીની પરીક્ષણ પ્રણાલીઓ કહેવાય છે, રિકોમ્બિનન્ટ અને પેપ્ટાઈડ્સ તરફ.

પુનઃસંયોજક પ્રોટીન બનાવવા માટેની તકનીક પૂરતા પ્રમાણમાં મેળવવાનું શક્ય બનાવે છે શુદ્ધ સ્વરૂપકોઈપણ વ્યક્તિગત એન્ટિજેનનું એનાલોગ.

ઉચ્ચ-ગુણવત્તાવાળી રિકોમ્બિનન્ટ ટેસ્ટ સિસ્ટમ બનાવવા માટે, પેથોજેનની સમગ્ર એન્ટિજેનિક વિવિધતામાંથી એન્ટિજેન્સ પસંદ કરવી જરૂરી છે જે અત્યંત ઇમ્યુનોજેનિક હશે (એટલે ​​​​કે, શરીરમાં સંક્રમિત વ્યક્તિઆ એન્ટિજેન્સ માટે એન્ટિબોડીઝ પૂરતા પ્રમાણમાં મોટી માત્રામાં ઉત્પન્ન થવી જોઈએ) અને અત્યંત વિશિષ્ટ (એટલે ​​​​કે, આપેલ પેથોજેનની લાક્ષણિકતા છે અને આપવી નહીં. ક્રોસ પ્રતિક્રિયાઓઅલગ પ્રકૃતિના એન્ટિબોડીઝ સાથે).

ઉપરાંત, મહાન મહત્વરિકોમ્બિનન્ટ પ્રોટીનને શુદ્ધ કરવાની ગુણવત્તા ધરાવે છે. આદર્શ રીતે, લગભગ 100% વિશિષ્ટતા અને ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા સાથે રિકોમ્બિનન્ટ ટેસ્ટ સિસ્ટમ મેળવવી શક્ય છે.

વ્યવહારમાં, આ પ્રાપ્ત કરવું હંમેશા શક્ય નથી, પરંતુ શ્રેષ્ઠ રિકોમ્બિનન્ટ ટેસ્ટ સિસ્ટમ્સની વિશિષ્ટતા 100% સુધી પહોંચે છે.

આમ, એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેના અસંદિગ્ધ ફાયદાઓને કારણે: રેકોર્ડિંગ પરિણામોના સ્વચાલિતતાને કારણે ઉપયોગમાં સરળતા, ઝડપ, ઉદ્દેશ્યતા, વિવિધ વર્ગોના ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિનનો અભ્યાસ કરવાની ક્ષમતા (જે માટે મહત્વપૂર્ણ છે. પ્રારંભિક નિદાનરોગો અને તેમનું પૂર્વસૂચન) હાલમાં લેબોરેટરી ડાયગ્નોસ્ટિક્સની મુખ્ય પદ્ધતિઓમાંની એક છે.

મુખ્યત્વે માં આધુનિક વેનેરોલોજી ELISA નો ઉપયોગ સિફિલિસના નિદાન માટે થાય છે (અન્ય પ્રતિક્રિયાઓ સાથે સંયોજનમાં), HIV ચેપ, વાયરલ હેપેટાઇટિસ. મર્યાદિત ડાયગ્નોસ્ટિક મૂલ્ય ધરાવે છે ક્લેમીડીયલ ચેપ, સાયટોમેગાલોવાયરસ ચેપઅને અન્ય હર્પેટિક ચેપ. ELISA પદ્ધતિનો ઉપયોગ વિવિધ ચેપી રોગો, હોર્મોન સ્તરો, ઓટોએન્ટિબોડીઝ અને કેન્સરના વિવિધ માર્કર્સમાં એન્ટિબોડીઝ નક્કી કરવા માટે પણ થાય છે.

20. રેડિયોઈમ્યુનોસે: સિદ્ધાંતો, પ્રકાર, અભ્યાસના મુખ્ય તબક્કાઓ, ઉપકરણો KDL માં અરજી.

રેડિયો ઇમ્યુનોસે (RIA), રેડિયો ઇમ્યુનોસે અથવા આઇસોટોપ ઇમ્યુનોસે, (એન્જ. રેડિયોઈમ્યુનોસે, આરઆઈએ) - પદ્ધતિ પ્રમાણીકરણજૈવિક રીતે સક્રિય પદાર્થોવી જૈવિક પ્રવાહી, ઇચ્છિત સ્થિર અને સમાન રેડિયોન્યુક્લાઇડ-લેબલવાળા પદાર્થોના ચોક્કસ બંધનકર્તા સિસ્ટમો (મોટાભાગે એટી સાથે) ના સ્પર્ધાત્મક બંધન પર આધારિત છે, ત્યારબાદ વિશેષ કાઉન્ટર્સ - રેડિયો સ્પેક્ટ્રોમીટર પર શોધ દ્વારા અનુસરવામાં આવે છે.

આ પદ્ધતિ સૌપ્રથમ 1950 ના દાયકામાં સોલોમન બેર્સન અને રોઝાલિન સુસમેન યાલો દ્વારા વિકસાવવામાં આવી હતી. આ પદ્ધતિનો ઉપયોગ કરીને, તેઓએ ડાયાબિટીસના દર્દીઓમાં ઇન્સ્યુલિન ક્લિયરન્સનો અભ્યાસ કર્યો. આ માટે આર. યલોને મળેલ નોબેલ પુરસ્કાર 1977 માં.

એન્ટિબોડીઝ અથવા એન્ટિજેન્સને લેબલ કરવા માટે, આયોડિન 125I ના આઇસોટોપનો મોટાભાગે ઉપયોગ થાય છે, જેનું અર્ધ જીવન 60 દિવસ હોય છે અને ઉચ્ચ ચોક્કસ કિરણોત્સર્ગીતા હોય છે.

હકીકત એ છે કે લેબલ થયેલ એન્ટિજેન ચોક્કસ માત્રામાં ઉમેરવામાં આવે છે, તે પદાર્થનો ભાગ જે એન્ટિબોડીઝ સાથે બંધાયેલો છે અને તે ભાગ જે શોધાયેલ અનલેબલ એન્ટિજેન સાથે સ્પર્ધાના પરિણામે અનબાઉન્ડ રહે છે તે નક્કી કરવાનું શક્ય છે. અભ્યાસ વિટ્રોમાં કરવામાં આવે છે. માટે આર. એ. મુક્તિ પ્રમાણભૂત સેટરીએજન્ટ્સ, જેમાંથી દરેક એક પદાર્થની સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે રચાયેલ છે. અભ્યાસ ઘણા તબક્કામાં હાથ ધરવામાં આવે છે: જૈવિક સામગ્રીને રીએજન્ટ્સ સાથે મિશ્રિત કરવામાં આવે છે, મિશ્રણ કેટલાક કલાકો સુધી ઉકાળવામાં આવે છે, મુક્ત અને બંધાયેલા કિરણોત્સર્ગી પદાર્થોને અલગ કરવામાં આવે છે, નમૂનાની રેડિયોમેટ્રી કરવામાં આવે છે અને પરિણામોની ગણતરી કરવામાં આવે છે. પદ્ધતિ અલગ છે ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા, તેનો ઉપયોગ રક્તવાહિની, અંતઃસ્ત્રાવી અને અન્ય પ્રણાલીઓના રોગોના નિદાનમાં, વંધ્યત્વ, ગર્ભ વિકાસ વિકૃતિઓના કારણો નક્કી કરવા, ઓન્કોલોજીમાં ટ્યુમર માર્કર્સ નક્કી કરવા અને સારવારની અસરકારકતા પર દેખરેખ રાખવા, ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિનની સાંદ્રતા નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે. ઉત્સેચકો અને ઔષધીય પદાર્થો. કેટલાક કિસ્સાઓમાં, અભ્યાસ લોડની પૃષ્ઠભૂમિ સામે કરવામાં આવે છે કાર્યાત્મક પરીક્ષણો(ઉદાહરણ તરીકે, ગ્લુકોઝ સહિષ્ણુતા પરીક્ષણની પૃષ્ઠભૂમિ સામે લોહીના સીરમમાં ઇન્સ્યુલિનના સ્તરનું નિર્ધારણ) અથવા સમય જતાં (ઉદાહરણ તરીકે, માસિક ચક્ર દરમિયાન લોહીમાં સેક્સ હોર્મોન્સનું નિર્ધારણ).

રેડિયોઇમ્યુનોસેમાં ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતા હોય છે. ઉદાહરણ તરીકે, ABBOTT - Austria II-I 125 ની કોમર્શિયલ કીટનો ઉપયોગ કરીને, 0.1 ng/ml સુધીની સાંદ્રતામાં HBsAg શોધવાનું શક્ય છે. પદ્ધતિના ફાયદાઓમાં ડિજિટલ શરતોમાં જવાબો મેળવવા સાથે પદ્ધતિને માનકીકરણ અને સ્વચાલિત કરવાની સંભાવનાનો સમાવેશ થાય છે. પદ્ધતિનો ગેરલાભ એ કિરણોત્સર્ગી સામગ્રી સાથેની કામગીરીના મોડ દ્વારા નિર્ધારિત મર્યાદાઓ છે, અને પ્રમાણમાં ટુંકી મુદત નુંડાયગ્નોસ્ટિક કીટની માન્યતા, જે કિરણોત્સર્ગી લેબલના સડો સાથે સંકળાયેલ છે.

ડાયગ્નોસ્ટિક કિટ્સહેપેટાઇટિસ A, B અને D વાયરસના વિવિધ એન્ટિજેન્સની શોધ માટે અને તેના માટે એન્ટિબોડીઝ આઇસોટોપ કંપની (તાશ્કંદ) અને કેટલીક વિદેશી કંપનીઓ (ઉદાહરણ તરીકે, એબીબીઓટીટી કંપની) દ્વારા બનાવવામાં આવે છે. પોલિસ્ટરીન બોલ્સ ("EBBOTT") અથવા ટેસ્ટ ટ્યુબ ("આઇસોટોપ") નો ઉપયોગ નક્કર તબક્કા તરીકે થાય છે. એન્ટિબોડીઝ અથવા એન્ટિજેન્સને લેબલ કરવા માટે, આઇસોટોપ I 125 નો મોટાભાગે ઉપયોગ થાય છે, જેનું અર્ધ જીવન 60 દિવસ અને ઉચ્ચ ચોક્કસ કિરણોત્સર્ગી છે. રેડિયોએક્ટિવ ટ્રેસરનું માપન, એટલે કે રેડિયેશન, ખાસ કાઉન્ટર્સ - રેડિયો સ્પેક્ટ્રોમીટર પર હાથ ધરવામાં આવે છે. નિયંત્રણ અને પરીક્ષણ નમૂના બંનેમાં કિરણોત્સર્ગી કઠોળની ગણતરી એક નિશ્ચિત સમયે, સામાન્ય રીતે 1 મિનિટની અંદર હાથ ધરવામાં આવે છે. પ્રતિક્રિયાના પરિણામોનું વિશ્લેષણ કરતી વખતે, પૃષ્ઠભૂમિ કિરણોત્સર્ગની હાજરીને ધ્યાનમાં લેવી જરૂરી છે, જે પ્રતિક્રિયાના અંતિમ પરિણામને અસર કરી શકે છે. કારણો એલિવેટેડ પૃષ્ઠભૂમિઆ હોઈ શકે છે: નમૂનાના કન્ટેનર અથવા માળખાનું દૂષણ; ખોટી ઉપકરણ સેટિંગ્સ; ઉપકરણની નજીક મજબૂત રેડિયેશનના સ્ત્રોતની હાજરી.

ખાતરી કરવા માટે હકારાત્મક પરિણામનમૂનાઓની પ્રારંભિક તપાસ દરમિયાન મેળવવામાં આવે છે, RIA દ્વારા પુનઃપરીક્ષા અથવા વૈકલ્પિક પરીક્ષણની ભલામણ કરવામાં આવે છે. જો HBsAg મળી આવે, તો પુષ્ટિકરણ પરીક્ષણ કરવું આવશ્યક છે.

Radioimmunoassay એ એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી પ્રતિક્રિયા પર આધારિત અત્યંત સંવેદનશીલ પદ્ધતિ છે, જેમાંથી એક ઘટકો રેડિયોએક્ટિવ લેબલ ધરાવે છે. પદ્ધતિ તમને એન્ટિજેન્સ અને એન્ટિબોડીઝ બંનેને શોધવા અને પરીક્ષણ નમૂનામાં તેમની સાંદ્રતા નક્કી કરવાની મંજૂરી આપે છે.

પદ્ધતિનો ઉપયોગ માઇક્રોબાયલ એન્ટિજેન્સને ઓળખવા, હોર્મોન્સ, ઉત્સેચકો, દવાઓ અને ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન નક્કી કરવા માટે થાય છે. એન્ટિજેન્સ અને એન્ટિબોડીઝ નક્કી કરવા માટે તે સૌથી સંવેદનશીલ પદ્ધતિ છે; તેનો ઉપયોગ હોર્મોન્સ, દવાઓ અને એન્ટિબાયોટિક્સ નક્કી કરવા, બેક્ટેરિયલ, વાયરલ, રિકેટ્સિયલ, પ્રોટોઝોલ રોગોનું નિદાન કરવા, રક્ત પ્રોટીન અને પેશી એન્ટિજેન્સનો અભ્યાસ કરવા માટે થાય છે.

ક્રોમેટોગ્રાફી: સૈદ્ધાંતિક આધાર, પદ્ધતિનો સિદ્ધાંત. ક્રોમેટોગ્રાફિક વિશ્લેષણ માટે સોર્બેન્ટ્સ અને એલ્યુએન્ટ્સ. ક્રોમેટોગ્રામ વિકસાવવા માટેની પદ્ધતિઓ. ક્રોમેટોગ્રાફીના મુખ્ય પ્રકારો: શોષણ, આયન વિનિમય, જેલ ફિલ્ટરેશન, એફિનિટી, એચપીએલસી. વિશ્લેષણાત્મક લાક્ષણિકતાઓ, ક્લિનિકલ એપ્લિકેશન.

ક્રોમેટોગ્રાફી (ગ્રીક χρώμα - રંગમાંથી) એ પદાર્થોના મિશ્રણને અલગ પાડવા અને તેનું વિશ્લેષણ કરવાની તેમજ પદાર્થોના ભૌતિક અને રાસાયણિક ગુણધર્મોનો અભ્યાસ કરવાની પદ્ધતિ છે. તે બે તબક્કાઓ વચ્ચે પદાર્થોના વિતરણ પર આધારિત છે - સ્થિર (નક્કર તબક્કો અથવા પ્રવાહી નિષ્ક્રિય વાહક પર બંધાયેલ, સોર્બન્ટ) અને મોબાઈલ (ગેસ અથવા પ્રવાહી તબક્કો, એલ્યુએન્ટ). પદ્ધતિનું નામ ક્રોમેટોગ્રાફીના પ્રથમ પ્રયોગો સાથે સંકળાયેલું છે, જે દરમિયાન પદ્ધતિના વિકાસકર્તા, મિખાઇલ ત્સ્વેતે તેજસ્વી રંગીન છોડના રંગદ્રવ્યોને અલગ કર્યા. ક્રોમેટોગ્રામ એ સમયસર કૉલમના આઉટલેટ પર ઘટકોની સાંદ્રતાની અવલંબનને રેકોર્ડ કરવાનું પરિણામ છે.

ક્રોમેટોગ્રાફીના મુખ્ય પ્રકારો અને.ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની પ્રકૃતિ કે જે એલુએન્ટ અને સ્થિર તબક્કા વચ્ચેના ઘટકોનું વિતરણ નક્કી કરે છે તેના આધારે, નીચેના મુખ્ય પ્રકારોને અલગ પાડવામાં આવે છે - શોષણ, વિતરણ, આયન વિનિમય, બાકાત (મોલેક્યુલર ચાળણી) અને અવક્ષેપ.

શોષણ ક્રોમેટોગ્રાફીશોષક (વિકસિત સપાટી સાથે ઘન) દ્વારા વિભાજિત પદાર્થોની સોર્બબિલિટીમાં તફાવતના આધારે; વિતરણ ક્રોમેટોગ્રાફી- સ્થિર તબક્કામાં મિશ્રણના ઘટકોની વિવિધ દ્રાવ્યતા પર (ઉચ્ચ-ઉકળતા પ્રવાહીને ઘન મેક્રોપોરસ વાહક પર જમા કરવામાં આવે છે) અને એલ્યુએન્ટ (તે ધ્યાનમાં રાખવું જોઈએ કે વિભાજનની વિતરણ પદ્ધતિ સાથે, ઘટક ઝોનની હિલચાલ ઘન સોર્બેન્ટ સાથે વિશ્લેષણ કરેલ ઘટકોની શોષણ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા આંશિક રીતે પ્રભાવિત થાય છે); આયન વિનિમય ક્રોમેટોગ્રાફી- સ્થિર તબક્કા (આયન એક્સ્ચેન્જર) અને મિશ્રણના ઘટકોને વિભાજિત કરવામાં આવતા વચ્ચેના આયન વિનિમય સંતુલન સ્થિરાંકોમાં તફાવત પર; બાકાત (મોલેક્યુલર ચાળણી) ક્રોમેટોગ્રાફી- સ્થિર તબક્કામાં ઘટક પરમાણુઓની વિવિધ અભેદ્યતા પર (અત્યંત છિદ્રાળુ નોનિયોનિક જેલ). વિશિષ્ટ ક્રોમેટોગ્રાફીજેલ પરમીએશન ફિલ્ટરેશન (GPC) માં વિભાજિત કરવામાં આવે છે, જેમાં એલ્યુએન્ટ બિન-જલીય દ્રાવક છે, અને જેલ ગાળણક્રિયા, જ્યાં એલ્યુએન્ટ પાણી છે. સેડિમેન્ટરી X એ નક્કર સ્થિર તબક્કા પર અવક્ષેપ કરવા માટે વિભાજિત ઘટકોની વિવિધ ક્ષમતા પર આધારિત છે.

ઇલ્યુઅન્ટના એકત્રીકરણની સ્થિતિ અનુસાર, ગેસ અને પ્રવાહીને અલગ પાડવામાં આવે છે. એક્સ.સ્થિર તબક્કાના એકત્રીકરણની સ્થિતિ પર આધાર રાખીને, ગેસ એક્સગેસ-શોષણ (સ્થિર તબક્કો - ઘન શોષક) અને ગેસ-પ્રવાહી (સ્થિર તબક્કો - પ્રવાહી), અને પ્રવાહી હોઈ શકે છે એક્સ- પ્રવાહી-શોષણ (અથવા ઘન-પ્રવાહી) અને પ્રવાહી-પ્રવાહી. બાદમાં, ગેસ-પ્રવાહીની જેમ, વિતરણ છે એક્સ.ઘન-પ્રવાહી એક્સપાતળા સ્તર અને કાગળનો સમાવેશ થાય છે.

ત્યાં સ્તંભાકાર અને પ્લેનર છે એક્સ.કૉલમ સિસ્ટમમાં, કૉલમ તરીકે ઓળખાતી ખાસ ટ્યુબ સોર્બેન્ટથી ભરેલી હોય છે, અને દબાણના તફાવતને કારણે મોબાઇલ તબક્કો કૉલમની અંદર જાય છે. સ્તંભાકારનો એક પ્રકાર એક્સ- રુધિરકેશિકા, જ્યારે સોર્બન્ટનો પાતળો પડ લાગુ પડે છે આંતરિક દિવાલોકેશિલરી ટ્યુબ. પ્લાનર એક્સપાતળા સ્તર અને કાગળમાં વિભાજિત. પાતળા સ્તરમાં એક્સદાણાદાર સોર્બન્ટ અથવા છિદ્રાળુ ફિલ્મનો પાતળો સ્તર કાચ અથવા ધાતુની પ્લેટો પર લાગુ થાય છે; કાગળના કિસ્સામાં એક્સખાસ ક્રોમેટોગ્રાફી પેપરનો ઉપયોગ કરો. પ્લેનર માં એક્સમોબાઇલ તબક્કાની હિલચાલ કેશિલરી દળોને કારણે થાય છે.

ક્રોમેટોગ્રાફી કરતી વખતે, આપેલ પ્રોગ્રામ અનુસાર તાપમાન, ઇલ્યુઅન્ટની રચના, તેના પ્રવાહ દર અને અન્ય પરિમાણોને બદલવાનું શક્ય છે.

સોર્બન્ટ સ્તર સાથે અલગ કરવા માટે મિશ્રણને ખસેડવાની પદ્ધતિના આધારે, ત્યાં વિવિધ છે નીચેના વિકલ્પો X:આગળનો, વિકાસલક્ષી અને દમનકારી. આગળના સંસ્કરણમાં, વાહક ગેસ અને વિભાજિત ઘટકોનું બનેલું એક અલગ મિશ્રણ, ઉદાહરણ તરીકે 1, 2, 3, 4, જે પોતે એક મોબાઇલ તબક્કો છે, તે સતત સોર્બન્ટ સ્તરમાં દાખલ થાય છે. પ્રક્રિયાની શરૂઆતના થોડા સમય પછી, ઓછામાં ઓછું છીણેલું ઘટક (ઉદાહરણ તરીકે, 1) બાકીના કરતા આગળ હોય છે અને દરેકની પહેલાં શુદ્ધ પદાર્થના ક્ષેત્ર તરીકે ઉભરી આવે છે, અને તેની પાછળ, સોર્બબિલિટીના ક્રમમાં, મિશ્રણના ઝોન. ઘટકો ક્રમિક રીતે સ્થિત છે: 1 + 2, 1 + 2 + 3, 1 + 2 + 3 + 4. વિકાસશીલ સંસ્કરણમાં, ઇલ્યુઅન્ટનો પ્રવાહ સતત સોર્બન્ટ સ્તરમાંથી પસાર થાય છે અને અલગ કરવા માટેના પદાર્થોનું મિશ્રણ સમયાંતરે દાખલ કરવામાં આવે છે. સોર્બન્ટ સ્તર. દ્વારા ચોક્કસ સમયપ્રારંભિક મિશ્રણને શુદ્ધ પદાર્થોમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે જે સોર્બન્ટ પર અલગ ઝોનમાં સ્થિત છે, જેની વચ્ચે એલ્યુએન્ટ ઝોન છે . ડિસ્પ્લેસમેન્ટ વર્ઝનમાં, અલગ કરવા માટેનું મિશ્રણ સોર્બન્ટમાં દાખલ કરવામાં આવે છે, અને પછી ડિસ્પ્લેસર (એલ્યુએન્ટ) ધરાવતું વાહક ગેસનો પ્રવાહ, જેની હિલચાલ દરમિયાન ચોક્કસ સમયગાળા પછી મિશ્રણને શુદ્ધ ઝોનમાં વિભાજિત કરવામાં આવશે. પદાર્થો, જેની વચ્ચે તેમના મિશ્રણના ઝોન હશે . સંખ્યાબંધ પ્રજાતિઓ એક્સકહેવાય ઉપકરણોનો ઉપયોગ કરીને હાથ ધરવામાં આવે છે ક્રોમેટોગ્રાફ્સ, જેમાંથી મોટા ભાગના વિકાસલક્ષી વિકલ્પ અમલમાં છે એક્સ.ક્રોમેટોગ્રાફ્સનો ઉપયોગ પૃથ્થકરણ માટે અને તૈયારીત્મક (ઔદ્યોગિક સહિત) પદાર્થોના મિશ્રણને અલગ કરવા માટે થાય છે. પૃથ્થકરણ દરમિયાન, ક્રોમેટોગ્રાફ સ્તંભમાં અલગ પડેલા પદાર્થો, ઇલ્યુએન્ટ સાથે મળીને, ક્રોમેટોગ્રાફિક કોલમના આઉટલેટ પર સ્થાપિત ડિટેક્શન ડિવાઇસમાં વિવિધ અંતરાલો પર દાખલ થાય છે, જે સમય જતાં તેમની સાંદ્રતા રેકોર્ડ કરે છે. પરિણામી આઉટપુટ વળાંકને ક્રોમેટોગ્રામ કહેવામાં આવે છે. ગુણાત્મક ક્રોમેટોગ્રાફિક વિશ્લેષણ માટે, નમૂનાના ઇન્જેક્શનની ક્ષણથી કૉલમમાંથી દરેક ઘટકની બહાર નીકળવાનો સમય આપેલ તાપમાને અને ચોક્કસ એલ્યુએન્ટનો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવે છે. જથ્થાત્મક પૃથ્થકરણ માટે, ક્રોમેટોગ્રાફિક શિખરોની ઊંચાઈ અથવા વિસ્તારો વિશ્લેષણ કરેલ પદાર્થો માટે ઉપયોગમાં લેવાતા ડિટેક્શન ડિવાઇસના સંવેદનશીલતા ગુણાંકને ધ્યાનમાં લઈને નક્કી કરવામાં આવે છે.

વિઘટન વિના વરાળની સ્થિતિમાં પસાર થતા પદાર્થોના વિશ્લેષણ અને વિભાજન માટે, સૌથી મોટી એપ્લિકેશનપ્રાપ્ત ગેસ ક્રોમેટોગ્રાફી,જ્યાં હિલીયમ, નાઇટ્રોજન, આર્ગોન અને અન્ય વાયુઓનો ઉપયોગ એલ્યુએન્ટ (વાહક ગેસ) તરીકે થાય છે. ગેસ શોષણ વિકલ્પ માટે એક્સસોર્બન્ટ તરીકે (0.1-0.5 વ્યાસવાળા કણો મીમી)વાપરવુ સિલિકા જેલ્સ, એલ્યુમિનિયમ જેલ્સ, મોલેક્યુલર ચાળણી, 5-500 ના ચોક્કસ સપાટી વિસ્તાર સાથે છિદ્રાળુ પોલિમર અને અન્ય સોર્બન્ટ્સ m 2 /g.ગેસ-પ્રવાહી માટે એક્સસોર્બન્ટને ફિલ્મના રૂપમાં પ્રવાહી લગાવીને તૈયાર કરવામાં આવે છે. µm 0.5-5 ના ચોક્કસ સપાટી વિસ્તાર સાથે નક્કર વાહક પર m 2 /gઅને વધુ. ગેસ શોષણ વિકલ્પ માટે ઓપરેટિંગ તાપમાન મર્યાદા એક્સ-70 થી 600 °C સુધી, ગેસ-પ્રવાહી માટે -20 થી 400 °C. ગેસ એક્સઅનેક વિભાજિત કરી શકાય છે સેમી 3ગેસ અથવા મિલિગ્રામપ્રવાહી (નક્કર) પદાર્થો; કેટલાકમાંથી વિશ્લેષણનો સમય સેકન્ડકેટલાક કલાકો સુધી.

પ્રવાહી સ્તંભમાં એક્સઅત્યંત અસ્થિર દ્રાવક (ઉદાહરણ તરીકે, હાઇડ્રોકાર્બન, ઇથર્સ, આલ્કોહોલ)નો ઉપયોગ એલ્યુએન્ટ્સ તરીકે થાય છે, અને સિલિકા જેલ્સ (જેમાં વિવિધ કાર્યાત્મક જૂથો સાથે સિલિકા જેલ્સનો સમાવેશ થાય છે જે સપાટી પર રાસાયણિક રીતે કલમી કરવામાં આવે છે - ઈથર, આલ્કોહોલ, વગેરે), એલ્યુમિનિયમ જેલ્સ, છિદ્રાળુ કાચ; આ બધા સોર્બેન્ટ્સના કણોનું કદ અનેક છે µm 50 સુધીના દબાણ હેઠળ એલ્યુએન્ટને ખોરાક આપવો Mn/m 2(500 kgf/cm 2), વિશ્લેષણનો સમય 2-3 થી ઘટાડવો શક્ય છે hકેટલાક સુધી મિનિટજટિલ મિશ્રણોને અલગ કરવાની કાર્યક્ષમતા વધારવા માટે, વિવિધ ધ્રુવીયતા (ગ્રેડિયન્ટ ઇલ્યુશન) ના દ્રાવકોને મિશ્રિત કરીને ઇલ્યુએન્ટના ગુણધર્મોમાં સમય-પ્રોગ્રામ કરેલ ફેરફારોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.

પાતળા સ્તર અને કાગળમાં એક્સપ્રવાહી સ્વરૂપમાં અભ્યાસ હેઠળનું મિશ્રણ પ્રારંભિક લાઇન (પ્લેટ અથવા કાગળની પટ્ટીની શરૂઆત) પર લાગુ કરવામાં આવે છે, અને પછી એલ્યુએન્ટના ચડતા અથવા ઉતરતા પ્રવાહ દ્વારા ઘટકોમાં વિભાજિત થાય છે. અલ્ટ્રાવાયોલેટ (યુવી) સ્પેક્ટ્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને ક્રોમેટોગ્રામ પર અલગ પડેલા પદાર્થોની અનુગામી શોધ (પ્રકટીકરણ) (જેમ કે આ કિસ્સાઓમાં સોર્બન્ટ સાથેની પ્લેટ અથવા ક્રોમેટોગ્રાફિક પેપર કે જેના પર અભ્યાસ હેઠળના મિશ્રણને ઘટકોમાં વિભાજિત કરવામાં આવે છે) કહેવામાં આવે છે. , ઇન્ફ્રારેડ (IR) સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી અથવા પ્રોસેસિંગ રીએજન્ટ કે જે વિશ્લેષણ કરેલા પદાર્થો સાથે રંગીન સંયોજનો બનાવે છે.

ગુણાત્મક રીતે આ પ્રકારોનો ઉપયોગ કરીને મિશ્રણની રચના એક્સઆપેલ પરિસ્થિતિઓમાં દ્રાવકની હિલચાલની ગતિને સંબંધિત પદાર્થોના ફોલ્લીઓની હિલચાલની ચોક્કસ ગતિ દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે. ક્રોમેટોગ્રામ પર પદાર્થના રંગની તીવ્રતાને માપીને જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ હાથ ધરવામાં આવે છે.

ક્રોમેટોગ્રાફીમલ્ટી કમ્પોનન્ટ સિસ્ટમ્સના ગુણાત્મક અને જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ માટે, ઉત્પાદન નિયંત્રણ, ખાસ કરીને ઘણી પ્રક્રિયાઓના સ્વચાલિતકરણના સંબંધમાં, તેમજ વ્યક્તિગત પદાર્થો (ઉદાહરણ તરીકે, ઉમદા ધાતુઓ) ના પ્રારંભિક (ઔદ્યોગિક સહિત) અલગતા માટે પ્રયોગશાળાઓ અને ઉદ્યોગોમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે. દુર્લભ ધાતુઓ અને છૂટાછવાયા તત્વો.
ગેસ ક્રોમેટોગ્રાફીતે માટે અરજી કરવામાં આવે છે વિભાજન વાયુઓ, અશુદ્ધિઓનું નિર્ધારણ હાનિકારક પદાર્થોહવા, પાણી, માટીમાં, ઔદ્યોગિક ઉત્પાદનો; મૂળભૂત કાર્બનિક અને પેટ્રોકેમિકલ સંશ્લેષણ, એક્ઝોસ્ટ ગેસ, દવાઓ, તેમજ ફોરેન્સિક વિજ્ઞાન વગેરેના ઉત્પાદનોની રચના નક્કી કરવી. અવકાશયાનમાં વાયુઓનું પૃથ્થકરણ કરવા, મંગળના વાતાવરણનું પૃથ્થકરણ કરવા, ઓળખવા માટેના સાધનો અને પદ્ધતિઓ કાર્બનિક પદાર્થચંદ્ર ખડકો વગેરેમાં
ગેસ ક્રોમેટોગ્રાફીનક્કી કરવા માટે પણ વપરાય છે ભૌતિક અને રાસાયણિક લાક્ષણિકતાઓવ્યક્તિગત સંયોજનો: શોષણ અને વિસર્જનની ગરમી, એન્થાલ્પી, એન્ટ્રોપી, સંતુલન સ્થિરાંકો અને જટિલ રચના; ઘન પદાર્થો માટે, આ પદ્ધતિ તમને ચોક્કસ સપાટી વિસ્તાર, છિદ્રાળુતા અને ઉત્પ્રેરક પ્રવૃત્તિને માપવા માટે પરવાનગી આપે છે.
પ્રવાહી ક્રોમેટોગ્રાફીકૃત્રિમ પોલિમર, દવાઓ, ડિટર્જન્ટ્સ, પ્રોટીન, હોર્મોન્સ અને અન્ય જૈવિક રીતે મહત્વપૂર્ણ સંયોજનોના વિશ્લેષણ, વિભાજન અને શુદ્ધિકરણ માટે વપરાય છે. અત્યંત સંવેદનશીલ ડિટેક્ટર્સનો ઉપયોગ તમને ખૂબ ઓછી માત્રામાં પદાર્થો સાથે કામ કરવાની મંજૂરી આપે છે (10 -11 -10 -9 જી), જે જૈવિક સંશોધનમાં અત્યંત મહત્વપૂર્ણ છે. મોલેક્યુલર ચાળણીનો વારંવાર ઉપયોગ થાય છે ક્રોમેટોગ્રાફીઅને ક્રોમેટોગ્રાફીસંબંધ દ્વારા; બાદમાં જૈવિક પદાર્થોના પરમાણુઓની પસંદગીયુક્ત રીતે એકબીજા સાથે જોડવાની ક્ષમતા પર આધારિત છે.
પાતળા સ્તર અને કાગળ ક્રોમેટોગ્રાફીચરબી, કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ, પ્રોટીન વગેરેના વિશ્લેષણ માટે વપરાય છે. કુદરતી પદાર્થોઅને અકાર્બનિક સંયોજનો.
કેટલાક કિસ્સાઓમાં, તેનો ઉપયોગ પદાર્થોને ઓળખવા માટે થાય છે ક્રોમેટોગ્રાફીઅન્ય ભૌતિક રાસાયણિક અને સાથે સંયોજનમાં ભૌતિક પદ્ધતિઓ દ્વારા, ઉદાહરણ તરીકે, માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી, IR, UV સ્પેક્ટ્રોસ્કોપી વગેરે સાથે. કમ્પ્યુટરનો ઉપયોગ ક્રોમેટોગ્રામને સમજવા અને પ્રાયોગિક પરિસ્થિતિઓ પસંદ કરવા માટે થાય છે.

એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA)તે એન્ટિબોડી સાથે એન્ટિજેનની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પર આધારિત છે, તેમાંના એક એન્ઝાઇમ ધરાવે છે. જ્યારે એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી સંકુલ રચાય છે, ત્યારે એન્ઝાઇમના પ્રભાવ હેઠળ ટેસ્ટ ટ્યુબ (અથવા ટેબ્લેટના કોષ) ની સામગ્રીનો રંગ બદલાય છે. પ્રાપ્ત પરિણામની તુલના ધોરણ સાથે કરવામાં આવે છે રંગ સ્કેલઅને એન્ટિજેન અને તેની માત્રા નક્કી કરો.
આ નિદાન પદ્ધતિને ઓળખવા માટે દવામાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાય છે રોગાણુઓ(ખાસ કરીને વાયરસ), હોર્મોન્સનું સ્તર નક્કી કરવા, લોહીમાં દવાઓ, એલર્જન, ચેપી રોગો(વાયરલ હેપેટાઇટિસ, રૂબેલા, હેપેટાઇટિસ, સાયટોમેગલી, વગેરે), રોગો રોગપ્રતિકારક તંત્રઅને જીવલેણ નિયોપ્લાઝમ.
અન્ય પ્રકારના ઇમ્યુનોડાયગ્નોસ્ટિક્સની તુલનામાં એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેના ફાયદા:
1) પ્રતિક્રિયાઓની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા - એક એન્ઝાઇમ પરમાણુ કારણ બની શકે છે નોંધપાત્ર ફેરફારોક્રિયાપ્રતિક્રિયા ઘટકોમાં;
2) પરીક્ષણ સામગ્રી (પ્લાઝમા અથવા સીરમ) ન્યૂનતમ જથ્થામાં જરૂરી છે;
3) લાંબા ગાળાના સંગ્રહસંશોધન માટે પ્રયોગશાળા ઉપભોક્તા;
4) પરિણામોનું મૂલ્યાંકન સાધનોનો ઉપયોગ કરીને અને "આંખ દ્વારા" બંને કરી શકાય છે;
5) દર્દી પાસેથી પરીક્ષણ સામગ્રીમાં એન્ટિજેન્સ અથવા એન્ટિબોડીઝની માત્રા નક્કી કરવી શક્ય છે;
6) અમલીકરણની સરળતા;
7) સ્વચાલિત વિશ્લેષકોનો ઉપયોગ કરીને વિશ્લેષણ હાથ ધરવાનું શક્ય છે;
8) નફાકારકતા.
એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે ઘણી રીતે હાથ ધરવામાં આવે છે. ઘન-તબક્કો (વિજાતીય) એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે સૌથી વધુ વખત કરવામાં આવે છે, જેમાં નક્કર સપાટી પર નિશ્ચિત એન્ટિજેન્સ અથવા એન્ટિબોડીઝ સાથે અદ્રાવ્ય રીએજન્ટનો ઉપયોગ શામેલ હોય છે. પરીક્ષણ સામગ્રીમાંથી અનુરૂપ ઘટકો (એન્ટિબોડીઝ અથવા એન્ટિજેન્સ) ઘન રીએજન્ટ દ્વારા શોષાય છે. ઘટકો કે જે આવા રીએજન્ટના સંપર્કમાં આવ્યા નથી તે સરળતાથી પ્લેટમાંથી દૂર કરવામાં આવે છે. આલ્કલાઇન ફોસ્ફેટેઝ, બી-ગેલેક્ટોસીડેઝ અને મોટાભાગે હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝનો ઉપયોગ ટેગ એન્ઝાઇમ તરીકે થાય છે. બાદમાં એન્ઝાઇમ ઉપલબ્ધ છે, ખૂબ જ સક્રિય અને તદ્દન સ્થિર છે.
હેપેટાઇટિસ બી વાયરસ એન્ટિજેન સૌપ્રથમ ઓસ્ટ્રેલિયન એબોરિજિન્સના લોહીના અભ્યાસમાં ઓળખવામાં આવ્યો હતો. આ એન્ટિજેનને ઓસ્ટ્રેલિયન કહેવાનું કારણ હતું, જે તબીબી પરિભાષામાં નિશ્ચિતપણે સ્થાયી થયું છે.
એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે ઓર્થો-ફેનીલેનેડિયામાઇન અને હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડની હાજરીમાં હાથ ધરવામાં આવે છે. જ્યારે તેઓ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે, ત્યારે એક પદાર્થ રચાય છે, જે ફોટોમેટ્રિક રીતે નક્કી કરવામાં આવે છે. એન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયાને રોકવા માટે, એક અવરોધક રીએજન્ટ, સલ્ફ્યુરિક એસિડનો ઉપયોગ થાય છે.
એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેનું પરિણામ સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવે છે. કેટલાક કિસ્સાઓમાં (જ્યારે ઓસ્ટ્રેલિયન એન્ટિજેન શોધી કાઢવામાં આવે છે), પરિણામોની વિશ્વસનીયતાની ખાતરી કરવા માટે પુષ્ટિ પ્રયોગશાળા પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે.
વિશ્લેષણના નિયમોનું સખત પાલન અને રીએજન્ટના ઉપયોગથી ભૂલભરેલા તારણો દૂર થાય છે.
એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે હાથ ધરવામાં આવે છે વિવિધ પદ્ધતિઓઅને માર્ગો. વાયરલ હેપેટાઇટિસના નિદાન માટે એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસે હાથ ધરવા માટે, ઘણા રીએજન્ટ્સનો ઉપયોગ થાય છે.
"સેન્ડવીચ પદ્ધતિ"
એન્ટિજેન્સ સાથેની પરીક્ષણ સામગ્રી ચોક્કસ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ નક્કર અદ્રાવ્ય સપાટી પર નિશ્ચિત એન્ટિબોડીઝમાં ઉમેરવામાં આવે છે. પછી અપ્રક્રિયા ન કરાયેલ ઘટકોને પ્લેટમાંથી દૂર કરવામાં આવે છે અને એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિબોડીઝને હેતુવાળા એન્ટિજેનમાં ઉમેરવામાં આવે છે. આગળ, ટેબ્લેટને ફરીથી અમુક શરતો હેઠળ રાખવામાં આવે છે અને જે ઘટકોએ પ્રતિક્રિયા આપી નથી તે દૂર કરવામાં આવે છે. એન્ટિજેન ટેબ્લેટ પર રહે છે, એન્ટિબોડીઝના સ્તરો વચ્ચે સેન્ડવીચ કરવામાં આવે છે. જો એન્ટિબોડી-એન્ટિજન-એન્ટિબોડી + એન્ઝાઇમ કોમ્પ્લેક્સ હાજર હોય, તો જ્યારે રાસાયણિક સબસ્ટ્રેટ ઉમેરવામાં આવે છે, ત્યારે તેનો રંગ બદલાય છે.
ELISA પદ્ધતિઓ:
1) નક્કર સપાટી પર નિશ્ચિત એન્ટિજેન્સ + એન્ટિબોડીઝ સાથે દર્દીની સામગ્રી + એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિબોડીઝ (દર્દીના ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન જી માટે એન્ટિબોડીઝ). આ રીએજન્ટ્સનો ઉપયોગ કરીને, હેપેટાઇટિસ સી વાયરસના એન્ટિબોડીઝ શોધી કાઢવામાં આવે છે;
2) નક્કર સપાટી પર નિશ્ચિત એન્ટિજેન્સ + એન્ટિબોડીઝ સાથે દર્દીની સામગ્રી + એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિજેન્સ. આ રીતે, Hbs એન્ટિજેન માટે એન્ટિબોડીઝ શોધી કાઢવામાં આવે છે (ઓસ્ટ્રેલિયન એન્ટિજેન - હીપેટાઇટિસ બીની નિશાની);
3) પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન્સ + એન્ટિબોડીઝ સાથે દર્દીની સામગ્રી + એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિબોડીઝ નક્કર સપાટી પર નિશ્ચિત છે. આ રીતે, હેપેટાઇટિસ B અને Dh E વાયરસના એન્ટિજેન્સ માટે એન્ટિબોડીઝ શોધી કાઢવામાં આવે છે;
4) નક્કર સપાટી પર નિશ્ચિત એન્ટિજેન + એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિબોડીઝ + દર્દીની સામગ્રી. હેપેટાઇટિસ A, B, C વાયરસ માટે એન્ટિબોડીઝ શોધવા માટે વપરાય છે.
એક-પગલાની "સેન્ડવીચ પદ્ધતિ"
આ અગાઉના વિશ્લેષણનું ઝડપી સંસ્કરણ છે. IN આ બાબતેપરીક્ષણ સામગ્રી અને એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિબોડીઝ એક જ સમયે નિશ્ચિત એન્ટિબોડીઝ સાથે પ્લેટમાં ઉમેરવામાં આવે છે. આ વિશ્લેષણને સરળ બનાવે છે અને તેનો સમય ઘટાડે છે.
મલ્ટિલેયર "સેન્ડવીચ પદ્ધતિ"
વિશ્લેષણ હાથ ધરવા માટે, દર્દીના એન્ટિબોડીઝ (ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન) માટે નિશ્ચિત એન્ટિબોડીઝ સાથેની પ્લેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, જેમાં દર્દીની સામગ્રી ઉમેરવામાં આવે છે. તે ચોક્કસ શરતો હેઠળ રાખવામાં આવે છે અને બિન-પ્રતિક્રિયાવાળા ઘટકો દૂર કરવામાં આવે છે. પછી પ્લેટના કુવાઓમાં પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન ઉમેરવામાં આવે છે, અને પ્રતિક્રિયાની સંખ્યાબંધ શરતો પૂરી થયા પછી, તેને દૂર કરવામાં આવે છે.
પ્રતિક્રિયા વિનાના ઘટકો. આગળ, કોશિકાઓમાં એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિબોડીઝ ઉમેરવામાં આવે છે. આ "સરળ સેન્ડવીચ" પદ્ધતિ કરતાં વધુ જટિલ અને સમય માંગી લેતું વિશ્લેષણ છે.
નક્કર સપાટી પર નિશ્ચિત એન્ટિબોડીઝ (ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન M માટે એન્ટિબોડીઝ) + એન્ટિબોડીઝ ધરાવતા દર્દીની સામગ્રી + પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન + એન્ઝાઇમ ધરાવતા એન્ટિબોડીઝ.
આ રીતે, હેપેટાઇટિસ A અને B વાયરસ માટે એન્ટિબોડીઝ (ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન M) શોધી કાઢવામાં આવે છે. એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે માટે અન્ય વિકલ્પો છે.

કામનો પ્રકાર:

દવા, શારીરિક શિક્ષણ, આરોગ્યસંભાળ

• ફાઇલ ફોર્મેટ:

  ફાઇલ કદ:

એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેના સિદ્ધાંતો, ELISA ના મુખ્ય પ્રકારો, ડાયગ્નોસ્ટિક્સમાં એપ્લિકેશન

તમે વિદ્યાર્થી પેપર લખવામાં મદદની કિંમત શોધી શકો છો.

એક કાગળ લખવામાં મદદ કરો જે ચોક્કસપણે સ્વીકારવામાં આવશે!

રાજ્ય શૈક્ષણિક સંસ્થાઉચ્ચ વ્યાવસાયિક શિક્ષણ

રશિયન સ્ટેટ મેડિકલ યુનિવર્સિટી

આરોગ્ય અને સામાજિક વિકાસ માટે ફેડરલ એજન્સી

નિબંધ

"એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેના સિદ્ધાંતો, ELISA ના મુખ્ય પ્રકારો, ડાયગ્નોસ્ટિક્સમાં એપ્લિકેશન"

સમોઇલિકોવ પાવેલ વ્લાદિમીરોવિચ

ક્લિનિકલ લેબોરેટરી ડાયગ્નોસ્ટિક્સ વિભાગના ઇન્ટર્ન

એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેના સિદ્ધાંતો, ELISA ના મુખ્ય પ્રકારો, ડાયગ્નોસ્ટિક્સમાં એપ્લિકેશન.

પરિચય.

તબીબી પ્રેક્ટિસમાં ઇમ્યુનોસે પદ્ધતિઓનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે. તમામ ક્ષેત્રોમાં આધુનિક દવાઇમ્યુનોસેનો ઉપયોગ મુખ્યત્વે ડાયગ્નોસ્ટિક અને વિશ્લેષણાત્મક હેતુઓ માટે થાય છે. તે ખાસ કરીને મહત્વનું છે કે તેઓ ઓછી અને ખૂબ ઓછી સાંદ્રતામાં જૈવિક ઘટકો (હોર્મોન્સ, એન્ઝાઇમ્સ, ન્યુરોપેપ્ટાઇડ્સ, રોગપ્રતિકારક તંત્રના ઉત્પાદનો, એન્ટિજેન્સ, વગેરે) ને ઓળખવાનું શક્ય બનાવે છે. બધા ઉત્પાદનો કે જેની સામે એન્ટિબોડીઝ મેળવી શકાય છે તે આ પદ્ધતિઓ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવે છે.

ઇમ્યુનોસે એન્ટિજેન (AG) અને એન્ટિબોડી (AT) નો ઉપયોગ કરીને ક્રિયાપ્રતિક્રિયા પર આધારિત છે વિવિધ વિકલ્પોઘટકોમાંથી એકનું લેબલિંગ (એન્ઝાઇમ, રેડિઓન્યુક્લાઇડ, ફ્લોરોસન્ટ ડાય, વગેરે). વિશિષ્ટ સાધનોનો ઉપયોગ કરીને પ્રતિક્રિયાનું મૂલ્યાંકન આપમેળે કરવામાં આવે છે, જે આ પદ્ધતિઓને પ્રમાણિત કરવાનું શક્ય બનાવે છે.

વપરાયેલ લેબલના પ્રકાર અને પરીક્ષણની શરતોના આધારે, ઇમ્યુનોસેને એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA), રેડિયોઇમ્યુનોસે (RIA), ઇમ્યુનોફ્લોરોસન્ટ અને અન્ય તરીકે નિયુક્ત કરવામાં આવે છે. જ્યારે પ્રતિક્રિયાઓ એક અથવા વધુ તબક્કામાં થાય છે, ત્યારે તેને પ્રત્યક્ષ અથવા પરોક્ષ તરીકે નિયુક્ત કરવામાં આવે છે. જે વાતાવરણમાં પ્રતિક્રિયા કરવામાં આવે છે તે મહત્વપૂર્ણ છે. જો પ્રતિક્રિયા સપાટી પર નિશ્ચિત રીએજન્ટ્સ સાથે હાથ ધરવામાં આવે છે, તો પરીક્ષણને ઘન તબક્કા તરીકે નિયુક્ત કરવામાં આવે છે, ઉદાહરણ તરીકે ELISA (એન્ઝાઇમ લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે).

આ કાર્યમાં, માત્ર એન્ઝાઇમ ઇમ્યુનોસેને જ ધ્યાનમાં લેવામાં આવશે - જીવવિજ્ઞાન અને દવામાં વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતી પદ્ધતિ, વ્યવહારિક અને મૂળભૂત બંને.

લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ પરીક્ષા.

ELISA 60 ના દાયકાના મધ્યમાં દેખાયો અને મૂળરૂપે હિસ્ટોલોજીકલ નમૂનામાં એન્ટિજેનને ઓળખવા માટેની પદ્ધતિ તરીકે વિકસાવવામાં આવી હતી, તેમજ ઇમ્યુનોડિફ્યુઝન અને ઇમ્યુનોઈલેક્ટ્રોફોરેસીસ પરીક્ષણોમાં વરસાદની રેખાઓ જોવા માટે, અને પછી એન્ટિજેન્સ અને એન્ટિબોડીઝના જથ્થાત્મક નિર્ધારણ માટે ઉપયોગમાં લેવાનું શરૂ થયું. જૈવિક પ્રવાહી. E. Engvall અને R. Pählman એ પદ્ધતિના વિકાસમાં તેમજ સ્વતંત્ર રીતે W. Van Weeman અને R. Schurs એ ભાગ લીધો હતો.

આકૃતિ 1. ELISA ના મૂળભૂત સિદ્ધાંત.

1) એન્ટિજેન્સ ઓળખવા. 2) એન્ટિબોડીઝ શોધવા માટે.

આ પદ્ધતિ એન્ટિજેન સાથે એન્ટિબોડીના ચોક્કસ બંધન પર આધારિત છે, જેમાં એક એન્ઝાઇમ સાથે જોડાયેલા ઘટકો છે; અનુરૂપ ક્રોમોજેનિક સબસ્ટ્રેટ સાથેની પ્રતિક્રિયાના પરિણામે, એક રંગીન ઉત્પાદન રચાય છે, જેનું પ્રમાણ નક્કી કરી શકાય છે. સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિકલી (ફિગ. 1).

વિવિધ કેરિયર્સ પર તેમની બંધનકર્તા પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખતા એન્ટિજેન અને એન્ટિબોડીને સ્થિર કરવાની શક્યતાની શોધે ELISA નો ઉપયોગ વિસ્તરણ કરવાનું શક્ય બનાવ્યું છે. વિવિધ વિસ્તારોજીવવિજ્ઞાન અને દવા.

મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝના ઉદભવે ELISA ના વધુ વિકાસમાં ફાળો આપ્યો, જેણે તેની સંવેદનશીલતા, વિશિષ્ટતા અને પરિણામોની પુનઃઉત્પાદનક્ષમતામાં વધારો કરવાનું શક્ય બનાવ્યું.

સૈદ્ધાંતિક રીતે, ELISA આધુનિક રોગપ્રતિકારક રસાયણશાસ્ત્ર અને રાસાયણિક એન્ઝાઇમોલોજી, એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી પ્રતિક્રિયાના ભૌતિક-રાસાયણિક નિયમોના જ્ઞાન તેમજ વિશ્લેષણાત્મક રસાયણશાસ્ત્રના મુખ્ય સિદ્ધાંતો પર આધારિત છે. ELISA ની સંવેદનશીલતા અને તે જે સમય લે છે તે ઘણા મુખ્ય પરિબળો દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે: એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી પ્રતિક્રિયાની ગતિ અને થર્મોડાયનેમિક લાક્ષણિકતાઓ, રીએજન્ટ્સનો ગુણોત્તર, એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિ અને તેની શોધ પદ્ધતિઓનું રિઝોલ્યુશન. IN સામાન્ય દૃશ્યએન્ટિજેન-એન્ટિબોડી પ્રતિક્રિયાને સરળ યોજના દ્વારા વર્ણવી શકાય છે:

+[AG]↔[ATAG]

લો-મોલેક્યુલર સંયોજનોથી લઈને વાયરસ અને બેક્ટેરિયા સુધીના વિવિધ સંશોધન પદાર્થો, તેમજ અસાધારણ વિશાળ વર્તુળ ELISA નો ઉપયોગ કરવા માટેની વિવિધ પરિસ્થિતિઓ સાથે સંકળાયેલ કાર્યો, અત્યંત વિકાસને નિર્ધારિત કરે છે મોટી માત્રામાંઆ પદ્ધતિના પ્રકારો.

ELISA ના કોઈપણ સંસ્કરણમાં 3 ફરજિયાત તબક્કાઓ શામેલ છે:

1. ચોક્કસ એન્ટિબોડી દ્વારા પરીક્ષણ સંયોજનની માન્યતાનો તબક્કો, જે રોગપ્રતિકારક સંકુલની રચના તરફ દોરી જાય છે;

2. રોગપ્રતિકારક સંકુલ સાથે અથવા મુક્ત બંધનકર્તા સ્થળો સાથે જોડાણના જોડાણની રચનાનો તબક્કો;

3. એન્ઝાઇમ લેબલને રેકોર્ડ કરેલ સિગ્નલમાં રૂપાંતરિત કરવાનો તબક્કો.

ELISA વર્ગીકરણ.

ELISA પદ્ધતિઓનું વર્ગીકરણ અનેક અભિગમો પર આધારિત છે:

1. ELISA ના પ્રથમ તબક્કે હાજર રીએજન્ટના પ્રકારને આધારે, સ્પર્ધાત્મક અને બિન-સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિઓને અલગ પાડવામાં આવે છે.

A) સ્પર્ધાત્મક ELISA માં, પ્રથમ તબક્કે, સિસ્ટમમાં વિશ્લેષિત સંયોજન અને તેના એનાલોગ બંને હોય છે, જેને એન્ઝાઇમ સાથે લેબલ કરવામાં આવે છે અને તેની સાથે ચોક્કસ બંધનકર્તા સાઇટ્સ માટે સ્પર્ધા કરે છે.

બી) બિન-સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિઓ માત્ર વિશ્લેષણ કરેલ સંયોજન અને તેના માટે વિશિષ્ટ બંધનકર્તા કેન્દ્રોની પ્રથમ તબક્કે સિસ્ટમમાં હાજરી દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે.

2. તમામ ELISA પદ્ધતિઓ સજાતીય અને વિજાતીયમાં વહેંચાયેલી છે.

જો ELISA ના ત્રણેય તબક્કાઓ ઉકેલમાં થાય છે અને મુખ્ય તબક્કાઓ વચ્ચે બિન-પ્રતિક્રિયા વિનાના ઘટકોમાંથી રચાયેલા રોગપ્રતિકારક સંકુલને અલગ કરવા માટે કોઈ વધારાના પગલાં નથી, તો પદ્ધતિ સજાતીય ઘટકોના જૂથની છે.

સજાતીય ELISA નો આધાર, નિયમ તરીકે, નીચા-પરમાણુ પદાર્થોના નિર્ધારણ માટે વપરાય છે, જ્યારે તે એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડી સાથે જોડાય છે ત્યારે એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિને અવરોધે છે. એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી પ્રતિક્રિયાના પરિણામે એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ પુનઃસ્થાપિત થાય છે.

જ્યારે એન્ટિબોડી એન્ઝાઇમ ટેગ ધરાવતા એન્ટિજેન સાથે જોડાય છે, ત્યારે ઉચ્ચ પરમાણુ વજન સબસ્ટ્રેટના સંદર્ભમાં એન્ઝાઇમની પ્રવૃત્તિ 95% દ્વારા અટકાવવામાં આવે છે, જે એન્ઝાઇમના સક્રિય કેન્દ્રમાંથી સબસ્ટ્રેટના સ્ટીરિક બાકાતને કારણે છે. જેમ જેમ એન્ટિજેનની સાંદ્રતા વધે છે તેમ, વધુ એન્ટિબોડીઝ બંધાય છે અને વધુ મુક્ત એન્ટિજેન-એન્ઝાઇમ સંયોજકો રહે છે, જે ઉચ્ચ પરમાણુ વજન સબસ્ટ્રેટને હાઇડ્રોલાઇઝ કરવા સક્ષમ છે. વિશ્લેષણ ખૂબ જ ઝડપથી હાથ ધરવામાં આવે છે, એક નિશ્ચય માટે 1 મિનિટની જરૂર છે. પદ્ધતિની સંવેદનશીલતા ખૂબ ઊંચી છે. તેનો ઉપયોગ પિકોમોલ સ્તરે પદાર્થ નક્કી કરવા માટે થઈ શકે છે.

વિજાતીય પદ્ધતિઓ ઘન વાહક તબક્કાની ભાગીદારી સાથે બે-તબક્કાની સિસ્ટમમાં વિશ્લેષણ દ્વારા વર્ગીકૃત થયેલ છે, અને બિન-પ્રતિક્રિયા વિનાના ઘટકો (ધોવા) માંથી રોગપ્રતિકારક સંકુલને અલગ કરવાના ફરજિયાત તબક્કામાં છે. વિવિધ તબક્કાઓ(રચના રોગપ્રતિકારક સંકુલનક્કર તબક્કામાં છે, અને પ્રતિક્રિયા વિનાના સંકુલ ઉકેલમાં છે). વિજાતીય પદ્ધતિઓ જેમાં પ્રથમ તબક્કે રોગપ્રતિકારક સંકુલની રચના ઘન તબક્કા પર થાય છે તેને ઘન-તબક્કાની પદ્ધતિઓ કહેવામાં આવે છે.

પદ્ધતિઓને સજાતીય-વિજાતીય તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવે છે જો તબક્કો 1 - વિશિષ્ટ સંકુલની રચના ઉકેલમાં થાય છે, અને પછી ઘટકોને અલગ કરવા માટે સ્થિર રીએજન્ટ સાથેના નક્કર તબક્કાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.

3. પરીક્ષણ પદાર્થ નક્કી કરવાના સિદ્ધાંત અનુસાર:

A) તેની સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતી બંધનકર્તા સાઇટ્સની સંખ્યા દ્વારા પદાર્થ (એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડી) ની સાંદ્રતાનું સીધું નિર્ધારણ. આ કિસ્સામાં, એન્ઝાઇમ લેબલ રચાયેલા વિશિષ્ટ AG-AT સંકુલમાં સ્થિત હશે. વિશ્લેષકની સાંદ્રતા રેકોર્ડ કરેલા સિગ્નલના સીધા પ્રમાણસર હશે.

બી) બંધનકર્તા સાઇટ્સ અને બાકીની મુક્ત બંધનકર્તા સાઇટ્સની કુલ સંખ્યામાં તફાવત દ્વારા પદાર્થની સાંદ્રતાનું નિર્ધારણ. આ કિસ્સામાં, વિશ્લેષકની સાંદ્રતા વધશે, અને રેકોર્ડ કરેલ સિગ્નલ ઘટશે; તેથી, આ કિસ્સામાં રેકોર્ડ કરેલ સિગ્નલની તીવ્રતા પર વિપરીત અવલંબન છે.

ELISA માં વપરાતા ઘટકોની લાક્ષણિકતાઓ.

ઉત્સેચકો.

એન્ઝાઇમ ટૅગ્સ અત્યંત શક્તિશાળી ઉત્પ્રેરક અસર ધરાવે છે; એક એન્ઝાઇમ પરમાણુ મોટી સંખ્યામાં સબસ્ટ્રેટ પરમાણુઓ સાથે પ્રતિક્રિયા કરી શકે છે. આમ, ઉત્પાદનની રચના અને તેના દ્વારા ઉત્પ્રેરિત થતી પ્રતિક્રિયા દ્વારા મિનિટની માત્રામાં હાજર એન્ઝાઇમ ઓળખી શકાય છે અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરી શકાય છે. લેબલ તરીકે એન્ઝાઇમનો ઉપયોગ કરવાનો બીજો ફાયદો એ છે કે અસંખ્ય કાર્યાત્મક જૂથો (સલ્ફહાઇડ્રેલ, કાર્બોક્સિલ, ટાયરાઝિન અવશેષો, વગેરે) ના પરમાણુમાં હાજરીને કારણે છે, જેના દ્વારા લિગાન્ડ પરમાણુઓ સહસંયોજક રીતે જોડી શકાય છે.

ELISA માં ઉપયોગમાં લેવાતા એન્ઝાઇમ માર્કર્સમાં નીચેના ગુણધર્મો હોવા આવશ્યક છે:

- વિશ્લેષણાત્મક પરિસ્થિતિઓમાં એન્ઝાઇમની ઉચ્ચ પ્રવૃત્તિ અને સ્થિરતા, જ્યારે સંશોધિત અને એન્ટિબોડીઝ અથવા અન્ય પ્રોટીન સાથે જોડાણમાં;

- સંવેદનશીલ સબસ્ટ્રેટ્સની હાજરી અને ઉત્સેચક પ્રતિક્રિયાના ઉત્પાદનો અથવા સબસ્ટ્રેટ્સ નક્કી કરવા માટેની પદ્ધતિની સરળતા;

- સબસ્ટ્રેટ સિસ્ટમ્સને વધુ મજબૂત કરવા માટે અનુકૂલિત કરવાની ક્ષમતા;

- અભ્યાસ હેઠળના જૈવિક પ્રવાહીમાં એન્ઝાઇમ અને તેના અવરોધકોની ગેરહાજરી.

ELISA માં ઓછામાં ઓછા 15 વિવિધ ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. ઉપરોક્ત જરૂરિયાતો અનુસાર સૌથી વધુ ઉપયોગમાં લેવાતા, હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ (HRP), આલ્કલાઇન ફોસ્ફેટેઝ (ALP) અને β-D-galactosidase (કોષ્ટક 1) છે. ત્રણેય સ્થિર છે અને અત્યંત સંવેદનશીલ પ્રતિક્રિયાઓને ઉત્પ્રેરિત કરે છે. વધુમાં, આ ઉત્સેચકો દ્વારા ઉત્પ્રેરિત પ્રતિક્રિયાઓના પરિણામે પેદા થતા ઉત્પાદનો, ઉપયોગમાં લેવાતા સબસ્ટ્રેટના આધારે, માત્ર રંગમિત્રિક પદ્ધતિઓ દ્વારા જ શોધી શકાય છે, પણ ફ્લોરોસન્ટ પદ્ધતિઓ. અન્ય ઉત્સેચકોનો ઉપયોગ ઘણી ઓછી વાર થાય છે. આ પીસી અને એપીની તુલનામાં તેમની ઓછી ચોક્કસ પ્રવૃત્તિ દ્વારા સમજાવવામાં આવે છે.

સબસ્ટ્રેટ્સ.

સબસ્ટ્રેટની પસંદગી મુખ્યત્વે ટેગ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાતા એન્ઝાઇમ દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે, કારણ કે એન્ઝાઇમ-સબસ્ટ્રેટ પ્રતિક્રિયા અત્યંત ચોક્કસ છે.

સબસ્ટ્રેટ માટે મૂળભૂત આવશ્યકતાઓ:

- સંયોજનમાં એન્ઝાઇમ શોધવામાં પદ્ધતિની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતાની ખાતરી કરવી;

- સારી રીતે માન્ય (ઉદાહરણ તરીકે, રંગીન) એન્ઝાઇમ-સબસ્ટ્રેટ પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનોની રચના;

- સબસ્ટ્રેટ સલામત, સસ્તું, સુલભ અને વાપરવા માટે અનુકૂળ હોવું જોઈએ.

કોષ્ટક 1.

	રસીદનો સ્ત્રોત			સંયોજક રીએજન્ટ
હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ	હોર્સરાડિશ (આર્મોરેસિયા રસ્ટીકાના)		ઓ-ફેનિલેનેડિયામાઇન ડાયહાઇડ્રોક્લોરાઇડ (OPD, 492 nm) 5-એમિનોસાલિસિલિક એસિડ (450 એનએમ), ડાયમિનોબેન્ઝિડિન, ઓ-ડાયનિસિડિન.	ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડ સોડિયમ મેટા-પિરિયોડેટ N-succinimidyl-3(2-pyridyldithio)propionate
β-D-galactosidase			O-nitrophenyl-β-D-galactoside (420 nm)	મેટા-મેલેમિડોબેન્ઝીન-એન-હાઈડ્રોક્સીસ્યુસિનિમાઈડ એસ્ટર
આલ્કલાઇન ફોસ્ફેટસ	ઇ. કોલી, વાછરડાના આંતરડાના મ્યુકોસા		પી-નાઇટ્રોફેનાઇલ ફોસ્ફેટ (405 એનએમ), 5-બ્રોમો-4-ક્લોરો-3-ઇન્ડોલિલ ફોસ્ફેટ	ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડ

વધુ વખત, ક્રોમોજેનિક સબસ્ટ્રેટનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, જે, જ્યારે નાશ પામે છે, ત્યારે રંગીન પદાર્થ બનાવે છે. ઉચ્ચ-ઊર્જા સબસ્ટ્રેટ્સનો ઉપયોગ - ફ્લોરોસન્ટ, કેમિલ્યુમિનેસન્ટ - આશાસ્પદ છે. આવા સબસ્ટ્રેટનો ઉપયોગ સૈદ્ધાંતિક રીતે બે ક્રમની તીવ્રતા દ્વારા ELISA ની સંવેદનશીલતા વધારવાનું શક્ય બનાવે છે.

એન્ટિજેન્સ અને એન્ટિબોડીઝ.

ELISA માં વપરાયેલ AG અને AT અત્યંત શુદ્ધ અને અત્યંત સક્રિય હોવા જોઈએ. વધુમાં, એન્ટિજેન્સમાં ઉચ્ચ એન્ટિજેનિસિટી, શ્રેષ્ઠ ઘનતા અને એન્ટિજેનિક નિર્ધારકોની સંખ્યા, વિદેશીતા અને એકરૂપતા હોવી આવશ્યક છે. વાયરસ અને બેક્ટેરિયાના ઘણા કૃત્રિમ અને પુનઃસંયોજક એન્ટિજેન્સે જ્યારે ELISA માં ઉપયોગ કર્યો ત્યારે પોતાને સારી રીતે સાબિત કર્યા છે. આનાથી ક્રોસ-પ્રતિક્રિયાઓને ઘટાડીને પદ્ધતિની વિશિષ્ટતા અને પુનઃઉત્પાદનક્ષમતામાં નોંધપાત્ર વધારો થયો છે.

ELISA માં સૌથી મહત્વપૂર્ણ રીએજન્ટ પૈકી એક એન્ટિબોડીઝ છે. ELISA ની સંવેદનશીલતા વપરાયેલી એન્ટિબોડીઝની સાંદ્રતા, પ્રવૃત્તિ અને વિશિષ્ટતા પર આધારિત છે. ઉપયોગમાં લેવાતા એન્ટિબોડીઝ પોલી- અથવા મોનોક્લોનલ, વિવિધ વર્ગો (IgG અથવા IgM) અને સબક્લાસ (IgGl, IgG2), એન્ટિ-એલોટાઇપિક અથવા એન્ટિ-આઇડિયોટાઇપિક હોઈ શકે છે. ઓછી એટી એફિનિટી પર, એજી-એટી કોમ્પ્લેક્સનું ભંગાણ સિસ્ટમમાંથી બાઉન્ડ એજીને દૂર કરવા તરફ દોરી જાય છે. મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરતી વખતે પદ્ધતિની સંવેદનશીલતા અને વિશિષ્ટતા વધે છે. આ કિસ્સામાં, તે શોધવાનું શક્ય બને છે ઓછી સાંદ્રતાપરીક્ષણ કરાયેલા નમૂનાઓમાં AG (AT).

સંયુક્ત રચના

કન્જુગેટ એ એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડી છે જે એન્ઝાઇમ ટેગ સાથે લેબલ થયેલ છે. સંયોજકની રચના તેમાંથી એક છે મહત્વપૂર્ણ તબક્કાઓ ELISA હાથ ધરે છે.

સંયોજક બનાવતી વખતે, એન્ઝાઇમ લેબલ રજૂ કરવા માટેની શ્રેષ્ઠ પદ્ધતિ પસંદ કરવામાં આવે છે જેથી કરીને સંયુગ્ધના બંને ઘટકો તેમની જૈવિક પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખે: એન્ઝાઇમ - સબસ્ટ્રેટ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરવાની ક્ષમતા, અને એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડી - એન્ટિજેનિસિટી અને એન્ટિજેન-બંધન પ્રવૃત્તિ. , અનુક્રમે. લેબલવાળા, અત્યંત શુદ્ધ એન્ટિજેનની હાજરી ઉપયોગની મંજૂરી આપે છે સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિઓ. આ કિસ્સામાં, અંતિમ તબક્કે સ્થિર એન્ટિબોડીઝ સાથે સંકળાયેલ ન હોય તેવા જોડાણની પ્રવૃત્તિને માપવાનું શક્ય છે, જે ધોવાની પ્રક્રિયાને ટાળે છે અને વિશ્લેષણને વધુ અનુકૂળ બનાવે છે. જો કે, એન્ટિજેન્સ તેમના ભૌતિક રાસાયણિક ગુણધર્મો અને બંધારણમાં વૈવિધ્યસભર છે, જેનો અર્થ એ છે કે એન્ટિજેન સાથે જોડાણ મેળવવા માટે સાર્વત્રિક પદ્ધતિઓ વિકસાવવી અશક્ય છે. આ કિસ્સામાં, એન્ટિજેન-એન્ઝાઇમ કન્જુગેટ મેળવવી એ એક અલગ પ્રક્રિયા છે. મુશ્કેલ કાર્ય. ELISA માટે લેબલવાળી એન્ટિબોડીઝની તૈયારી પદ્ધતિસર વધુ સુલભ છે.

ઇમ્યુનોકેમિકલ સક્રિય પ્રોટીન સાથે એન્ઝાઇમનું જોડાણ હાથ ધરવામાં આવે છે વિવિધ પદ્ધતિઓ: રાસાયણિક ક્રોસ-લિંકિંગ, એજી અથવા એટી સાથે એન્ઝાઇમ પરમાણુનું સહસંયોજક બંધન અને બિન-સહસંયોજક બોન્ડ્સ દ્વારા સંયોજનોની રચના, ઉદાહરણ તરીકે, જ્યારે એન્ઝાઇમ અને એજી અથવા એટી વચ્ચેનું જોડાણ રોગપ્રતિકારક રીતે હાથ ધરવામાં આવે છે, એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા .

સંયોજકો તૈયાર કરવા માટે સહસંયોજક પદ્ધતિઓનો સૌથી વધુ ઉપયોગ થાય છે. બંધનકર્તા પ્રતિક્રિયાની પસંદગી ઉપલબ્ધ પ્રકાર દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે કાર્યાત્મક જૂથોઆ પ્રોટીન પરમાણુઓમાં. ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડ, સોડિયમ પિરીયડેટ, વગેરેનો ઉપયોગ એન્ઝાઇમને એન્ટિજેન અને એન્ટિબોડી અણુઓમાં દાખલ કરવા માટે રીએજન્ટ તરીકે થાય છે.

ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડનો ઉપયોગ કરીને સંયોજકો મેળવવા માટે એક-પગલાની અને બે-પગલાની પદ્ધતિઓ છે. ઓછી એન્ઝાઈમેટિક પ્રવૃત્તિ (15 - 60% ફ્રી એન્ઝાઇમ) સાથે વિવિધ કદના જોડાણો રચી શકાય છે. પરિણામી જોડાણ મોટા કદપરીક્ષણ પદાર્થના નિર્ધારણમાં સ્ટીરીલી અવરોધ લાવી શકે છે. પ્રમાણમાં ઓછા પરમાણુ વજનવાળા જોડાણમાં ફેબ ટુકડો અને એક એન્ઝાઇમ પરમાણુ હોય છે.

બે-તબક્કાના સંશ્લેષણના પરિણામે, જેમાં પ્રથમ ક્રોસ-લિંકિંગ એજન્ટ સાથે સંશોધિત એન્ઝાઇમનું પગલું-દર-પગલું ઉત્પાદન, તેનું અલગીકરણ અને પછી એન્ટિજેન (એન્ટિબોડી), અણુઓ સાથે તેની અનુગામી ક્રિયાપ્રતિક્રિયાનો સમાવેશ થાય છે. સજાતીય રચના રચાય છે, જેમાં ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન પરમાણુ દીઠ 1-2 એન્ઝાઇમ પરમાણુઓ હોય છે અને ઉચ્ચ એન્ઝાઇમેટિક અને રોગપ્રતિકારક પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખે છે. જો કે, રચાયેલા આવા સંયોજનોની સંખ્યા ઓછી છે (હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ માટે તે 5-10% છે).

સોડિયમ પિરીયડેટ સાથે એન્ઝાઇમના કાર્બોહાઇડ્રેટ ઘટકના ઓક્સિડેશનના આધારે ઇમ્યુનોપેરોક્સિડેઝ કન્જુગેટ્સ મેળવવાની પદ્ધતિમાં સૌથી વધુ વ્યવહારુ ઉપયોગ જોવા મળ્યો છે (પેરોક્સિડેઝનું જોડાણ એન્ઝાઇમની પ્રારંભિક રકમના 70-90% સુધી પહોંચે છે).

વિશ્વસનીય જોડાણમાં નીચેના ગુણધર્મો હોવા આવશ્યક છે:

ઉચ્ચ એન્ટિબોડી શક્તિ અને એન્ટિજેન માટે ઉચ્ચ આકર્ષણ કે જેથી તેનો ઉપયોગ ઉચ્ચ મંદનમાં થઈ શકે અને આમ બિન-વિશિષ્ટ બંધન ઘટાડે છે;

વર્કિંગ ડિલ્યુશનમાં પૂરતી વિશિષ્ટતા;

પોલિમેરિક રાશિઓ પર મોનોમેરિક સ્વરૂપોનું વર્ચસ્વ, કારણ કે પોલિમર સ્વરૂપો બિન-વિશિષ્ટપણે પ્લાસ્ટિકને વળગી રહે છે, પરિણામે પ્રતિક્રિયાના ઉચ્ચ પૃષ્ઠભૂમિ સ્તરમાં પરિણમે છે;

એન્ઝાઇમ અને એન્ટિબોડીઝ વચ્ચેનો શ્રેષ્ઠ દાઢ ગુણોત્તર (શ્રેષ્ઠ ગુણોત્તર લગભગ 1:1 છે);

કોન્જુગેટની પૂરતી એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિ. આ ગુણધર્મ મુખ્યત્વે સંયોજનની સ્થિતિ અને સંયુગમાં એન્ઝાઇમ પરમાણુઓ અને એન્ટિબોડીઝના ગુણોત્તર દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે.

નક્કર તબક્કો

ELISA માટે નક્કર તબક્કા તરીકે વિવિધ સામગ્રીનો ઉપયોગ કરી શકાય છે: પોલિસ્ટરીન, પોલીવિનાઇલ ક્લોરાઇડ, પોલીપ્રોપીલિન અને અન્ય પદાર્થો. નક્કર તબક્કો ટેસ્ટ ટ્યુબની દિવાલો, 96-વેલ અને અન્ય પ્લેટ્સ, બોલ્સ, મણકા, તેમજ નાઈટ્રોસેલ્યુલોઝ અને અન્ય પટલ હોઈ શકે છે જે પ્રોટીનને સક્રિય રીતે શોષી લે છે.

નક્કર તબક્કામાં એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડીઝનું સ્થિરીકરણ ત્રણ રીતે શક્ય છે:

- પ્રોટીન અને કૃત્રિમ સપાટી વચ્ચે મજબૂત હાઇડ્રોફોબિક ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ પર આધારિત નિષ્ક્રિય શોષણ;

- નક્કર તબક્કામાં સહસંયોજક જોડાણ;

– રોગપ્રતિકારક રાસાયણિક, વગેરે.

ટાઇટ્રેશન પ્લેટ્સ અને નાઇટ્રોસેલ્યુલોઝ મેમ્બ્રેન પર ELISA કરતી વખતે નિષ્ક્રિય પ્રોટીન શોષણનો વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે. નિષ્ક્રિય શોષણ સંતૃપ્તિ સિદ્ધાંતને અનુસરે છે અને શોષિત પદાર્થના પરમાણુ વજન સાથે સંબંધ ધરાવે છે. વિવિધ પ્રકારના મેમ્બ્રેનની શોષણ સપાટી (નાઈટ્રોસેલ્યુલોઝ, નાયલોન, વગેરે) પ્લાસ્ટિકની તુલનામાં 100-1000 ગણી વધારે છે.

પોલિસેકરાઇડ્સ અને અત્યંત ગ્લાયકોસાઇલેટેડ પ્રોટીનમાં ઘણી વખત પોલિસ્ટરીન માટે ઓછું આકર્ષણ હોય છે. તેમને સ્થિર કરવા માટે અન્ય પદ્ધતિઓની જરૂર છે, જેમ કે ગ્લુટારાલ્ડીહાઇડનો ઉપયોગ કરીને સહસંયોજક જોડાણ. જ્યારે નક્કર તબક્કા તરીકે હાઇડ્રોફિલિક મણકા (એગરોઝ) અને પોલિસ્ટરીન મણકાનો ઉપયોગ કરવામાં આવે ત્યારે સહસંયોજક જોડાણ અસરકારક છે.

ઇમ્યુનોકેમિકલ પદ્ધતિઓ એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડીઝને સ્થિર કરવા માટે પૂર્વ-શોષિત "ટ્રેપ" એન્ટિબોડીઝના ઉપયોગ પર આધારિત છે. ઇમ્યુનોકેમિકલ રીતે સ્થિર એન્ટિજેન નિષ્ક્રિય રીતે શોષિત એન્ટિજેન કરતાં 10 ગણું વધુ સક્રિય છે. બેક્ટેરિયામાંથી લેક્ટિન્સ અથવા ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન-બંધનકર્તા પ્રોટીન કે જે પ્લાસ્ટિક અથવા અન્ય હાઇડ્રોફોબિક સપાટી પર સરળતાથી શોષાય છે તેનો ઉપયોગ કરી શકાય છે, જેમ કે કોન્કનાવાલિન A (Con A) અથવા સ્ટેફાયલોકોકલ પ્રોટીન A. કોન A HIV વાયરસનું પ્રોટીન, gp 120 ને સ્થિર કરવામાં સક્ષમ છે.

નક્કર તબક્કાની સપાટી પરની મુક્ત સાઇટ્સ જે સોર્બ્ડ એજન્ટ સાથે બંધાયેલી નથી તે પરીક્ષણ દરમિયાન કન્જુગેટ્સ સહિત અન્ય પરમાણુઓને ઠીક કરી શકે છે, જે પૃષ્ઠભૂમિ સંકેતમાં વધારો તરફ દોરી જાય છે. બિન-વિશિષ્ટ બંધનને રોકવા માટે, સ્થિરતા પછી, આધાર સામગ્રીના નક્કર તબક્કાને એવા પદાર્થો સાથે ગણવામાં આવે છે જે પરીક્ષણ માટે તટસ્થ હોય છે. સૌથી વધુ લોકપ્રિય બ્લોકીંગ એજન્ટો બોવાઇન સીરમ આલ્બુમિન (BSA), કેસીન વગેરે છે. બ્લોકીંગ એજન્ટની પસંદગી અને આ તબક્કા માટેની શરતો નક્કર તબક્કાના પ્રકાર અને સિસ્ટમની સંવેદનશીલતા પર આધારિત છે.

ELISA કરવા માટેના વિકલ્પો.

સામાન્ય સિદ્ધાંત.

હાલમાં, ELISA ની વિવિધ જાતો અને ફેરફારોની વિશાળ સંખ્યામાં ઉપયોગ થાય છે. એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA) ના વિવિધ પ્રકારો વ્યાપક બન્યા છે.

ઘન તબક્કો ELISA 1971 માં પ્રસ્તાવિત કરવામાં આવ્યો હતો. સોલિડ-ફેઝ ELISA ના મૂળભૂત સિદ્ધાંતો, ફેરફારને ધ્યાનમાં લીધા વિના, નીચે મુજબ છે:

1. પ્રતિક્રિયાના તબક્કા 1 પર, એન્ટિજેન્સ અથવા એન્ટિબોડીઝ ઘન તબક્કા પર શોષાય છે. આ કિસ્સામાં, નક્કર તબક્કામાં બંધાયેલા ન હોય તેવા રીએજન્ટ્સ સરળતાથી ધોવા દ્વારા દૂર કરવામાં આવે છે.

2. પરીક્ષણ નમૂના સંવેદનશીલ કુવાઓમાં ઉકાળવામાં આવે છે. હકારાત્મક નિયંત્રણ કુવાઓ પ્રમાણભૂત રીએજન્ટ ધરાવે છે. આ કિસ્સામાં, નક્કર તબક્કાની સપાટી પર રોગપ્રતિકારક સંકુલ રચાય છે. અનબાઉન્ડ ઘટકો ધોવા દ્વારા દૂર કરવામાં આવે છે.

3. જ્યારે એન્ટિબોડી-એન્ઝાઇમ અથવા એન્ટિજેન-એન્ઝાઇમ કન્જુગેટ ઉમેરવામાં આવે છે અને સ્થિર રોગપ્રતિકારક સંકુલમાં બંધાયેલ હોય છે, ત્યારે એન્ઝાઇમની સક્રિય સાઇટ સબસ્ટ્રેટ સાથે અનુગામી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા માટે ઉપલબ્ધ રહે છે. સ્થિર સંયોજક સાથે કુવાઓમાં સબસ્ટ્રેટનું સેવન રંગ પ્રતિક્રિયાના વિકાસ તરફ દોરી જાય છે. આ પ્રતિક્રિયા ઇચ્છિત તબક્કે બંધ કરી શકાય છે, સ્ટેનિંગની તીવ્રતા દૃષ્ટિની અથવા ઓપ્ટિકલ ઘનતા દ્વારા આકારણી કરી શકાય છે.

નક્કર-તબક્કાના વિશ્લેષણના કોઈપણ પ્રકારનો એક મહત્વપૂર્ણ તબક્કો એ અનબાઉન્ડ રીએજન્ટ્સથી ધોવાની પ્રક્રિયા છે. તે માત્ર નક્કર તબક્કામાં નિશ્ચિત ઘટકોને કોગળા કરવા માટે જ નહીં, પરંતુ સ્તરની સંપૂર્ણ ઊંડાઈમાંથી રીએજન્ટ્સને દૂર કરવા માટે મહત્વપૂર્ણ છે. આ વિશ્લેષણના સૌથી વધુ સમય માંગી લેનાર અને શ્રમ-સઘન તબક્કાઓ છે. વિશિષ્ટ ઉપકરણનો ઉપયોગ કરીને નમૂનાઓ આપમેળે ધોઈ શકાય છે - એક વોશર અથવા મલ્ટીચેનલ પાઇપેટનો ઉપયોગ કરીને. ELISA હાથ ધરવા માટે તમારે આની જરૂર છે:

- પોલિસ્ટરીન ટેબ્લેટ અથવા અન્ય નક્કર તબક્કાના વિકલ્પોનો ઉપયોગ;

- ધોવાનું સોલ્યુશન;

- સંયુક્ત (એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા એન્ટિજેન્સ અથવા એન્ટિબોડીઝ);

- વપરાયેલ સબસ્ટ્રેટનું મિશ્રણ;

- સ્ટોપિંગ સોલ્યુશન (સ્ટોપ રીએજન્ટ - પ્રતિક્રિયા રોકવા માટેનું સોલ્યુશન);

- સકારાત્મક અને/અથવા નકારાત્મક નિયંત્રણ માટે વપરાતા નમૂનાઓ;

- પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન (કેલિબ્રેશન વળાંક બાંધવા માટે);

- સિંગલ- અને મલ્ટિચેનલ પાઇપેટ્સ;

- વોશર (વોશર);

– ટેસ્ટ સોલ્યુશનની ઓપ્ટિકલ ડેન્સિટી નક્કી કરવા માટે એક ઓપ્ટિકલ ડિવાઇસ (ELISA રીડર, રીડર જે ક્રમિક રીતે તમામ કુવાઓને ફોટોમીટર કરે છે);

– 5-100 µl જૈવિક સામગ્રીનો અભ્યાસ કરવામાં આવી રહ્યો છે.

ડાયરેક્ટ ELISA

1. એન્ટિજેન્સ અથવા એન્ટિબોડીઝ (પરીક્ષણ સામગ્રી) પેનલ્સના કુવાઓમાં શોષાય છે. ઉપર નોંધ્યું હતું કે એન્ટિજેન્સ તેમની શોષણ કરવાની ક્ષમતામાં નોંધપાત્ર રીતે અલગ પડે છે વિવિધ પ્રકારોતેઓ કયા વર્ગના પદાર્થો (પ્રોટીન, કાર્બોહાઇડ્રેટ્સ અથવા લિપોપ્રોટીન) થી સંબંધિત છે તેના આધારે પ્લાસ્ટિક. ઘણી વખત ડાયરેક્ટ ELISA માં, નક્કર તબક્કા પર સ્થિર એન્ટિજેન કોષો અને અન્ય કોર્પસ્ક્યુલર એન્ટિજેન્સ છે.

2. “BSA કેસીન અને અન્યનો ઉપયોગ કરીને નક્કર તબક્કા પર બાકી રહેલ મુક્ત બંધનકર્તા સાઇટ્સને અવરોધિત કરો (નક્કર તબક્કા પર જોડાણના બિન-વિશિષ્ટ વર્ગીકરણને રોકવા માટે).

3. એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝ અથવા એન્ટિજેન્સ (સંયુક્ત) કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે અને ઉકાળવામાં આવે છે. નક્કર તબક્કામાં જોડાણનું બંધન ત્યારે જ થશે જ્યારે સિસ્ટમના બંને ઘટકો પૂરક હોય. કન્જુગેટ સાથે ઇન્ક્યુબેશન પછી, કુવાઓ ધોવાઇ જાય છે, આમ કન્જુગેટના અનબાઉન્ડ ભાગને દૂર કરવામાં આવે છે.

4. ઉપયોગમાં લેવાતા એન્ઝાઇમ માટે વિશિષ્ટ સબસ્ટ્રેટ પછી કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે અને ઉકાળવામાં આવે છે. એકવાર હકારાત્મક નિયંત્રણ કુવાઓમાં સ્ટેનિંગનું શ્રેષ્ઠ સ્તર પ્રાપ્ત થઈ જાય, પછી એન્ઝાઈમેટિક પ્રતિક્રિયા બંધ થઈ જાય છે.

5. પ્રતિક્રિયા માટે એકાઉન્ટિંગ. પ્રથમ, પ્રતિક્રિયાના પરિણામોને દૃષ્ટિની રીતે ધ્યાનમાં લેવામાં આવે છે. પરિણામોના વધુ સચોટ રેકોર્ડિંગ માટે, યોગ્ય પ્રકાશ ફિલ્ટર સાથે ELISA રીડરનો ઉપયોગ કરીને સ્ટેનિંગની તીવ્રતાનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવે છે. વિશ્લેષણના પરિણામોના આધારે, એકાગ્રતા પર ઓપ્ટિકલ ઘનતાની અવલંબનનો ગ્રાફ બનાવવામાં આવે છે (ફિગ. 2).

આકૃતિ 2. ડાયરેક્ટ ELISA.

a) એન્ટિજેન ઓળખવા માટે; b) એન્ટિબોડીઝ શોધવા માટે.

પરોક્ષ ELISA

ELISA નું આ સંસ્કરણ સામાન્ય રીતે ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝ શોધવા માટે વપરાય છે. પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન પેનલના કુવાઓમાં શોષાય છે અને સીરમ અથવા અન્ય નમૂનાઓ સાથે ઉકાળવામાં આવે છે. જૈવિક સામગ્રી, દર્દી પાસેથી પ્રાપ્ત ( cerebrospinal પ્રવાહી, લાળ, વગેરે). નક્કર તબક્કામાં એન્ટિજેન સાથે બંધાયેલા ચોક્કસ એન્ટિબોડીઝ એન્ટિગ્લોબ્યુલિન કન્જુગેટનો ઉપયોગ કરીને શોધી કાઢવામાં આવે છે. વિશ્લેષણના હેતુ પર આધાર રાખીને, વિવિધ એન્ટિગ્લોબ્યુલિન રીએજન્ટ્સનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, જે તમામ આઇસોટાઇપ્સના એન્ટિબોડીઝને શોધી કાઢે છે, અથવા વ્યક્તિગત વર્ગો અને ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિનના પેટા વર્ગો માટે વિશિષ્ટ છે. પદ્ધતિનો મુખ્ય ફાયદો એ સંયુગેટની વૈવિધ્યતા છે. સમાન સંયોજકનો ઉપયોગ કોઈપણ નમૂનામાં વિવિધ પ્રકારના એન્ટિજેન્સ માટે માનવ એન્ટિબોડીઝને શોધવા માટે થઈ શકે છે. પ્રતિક્રિયા પદ્ધતિસરની રીતે સરળ છે.

એન્ટિબોડીઝના નિર્ધારણ માટે પરોક્ષ ELISA ના મુખ્ય તબક્કાઓ:

1. એન્ટિજેન ઘન તબક્કા પર શોષાય છે, પછી અનબાઉન્ડ ઘટકોને દૂર કરવા માટે ધોવાઇ જાય છે.

2. ફ્રી બંધનકર્તા સાઇટ્સને અવરોધિત કરો. ધોવાઇ.

3. પરીક્ષણ સામગ્રી કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે, ઉકાળવામાં આવે છે, અને પછી ધોવાની પ્રક્રિયા હાથ ધરવામાં આવે છે. સમાંતર, હકારાત્મક અને નકારાત્મક નિયંત્રણો સાથેના નમૂનાઓ મૂકવામાં આવે છે.

4. વર્કિંગ ડિલ્યુશનમાં એન્ટિગ્લોબ્યુલિન કન્જુગેટ ઉમેરો, ઈનક્યુબેટ કરો અને અનબાઉન્ડ ઘટકોને ધોઈ લો.

5. સબસ્ટ્રેટ ઉમેરવામાં આવે છે અને ઉકાળવામાં આવે છે. એકવાર હકારાત્મક નિયંત્રણ કુવાઓમાં સ્ટેનિંગનું શ્રેષ્ઠ સ્તર પ્રાપ્ત થઈ જાય, સ્ટોપ સોલ્યુશન ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવે છે.

6. ELISA રીડર (ફિગ. 3) નો ઉપયોગ કરીને પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનની માત્રાને માપો.

શ્રેષ્ઠ વિશ્લેષણ પરિસ્થિતિઓ હેઠળ, પદ્ધતિ અત્યંત વિશિષ્ટ અને સંવેદનશીલ છે. તે અભ્યાસ કરાયેલા દર્દીઓના સેરામાં એન્ટિબોડીઝના નેનોગ્રામ જથ્થાને શોધવાનું શક્ય બનાવે છે. સંતોષકારક પરિણામો મેળવવા માટે, રીએજન્ટ્સ અને પદ્ધતિસરની તકનીકોનું માનકીકરણ જરૂરી છે. ELISA ના આ સંસ્કરણનો ઉપયોગ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝના પરીક્ષણ માટે પણ થઈ શકે છે.

“સેન્ડવિચ” એ એન્ટિજેન્સ શોધવા માટે ELISA નું એક પ્રકાર છે.

આ ELISA વેરિઅન્ટનો ઉપયોગ કરીને શોધાયેલ એન્ટિજેન્સમાં એન્ટિબોડીઝને બાંધવા માટે સક્ષમ બહુવિધ એપિટોપ્સ હોવા જોઈએ, અથવા સમાન વિશિષ્ટતાના પુનરાવર્તિત, અવકાશી રીતે વિભાજિત એપિટોપ્સ હોવા જોઈએ.

ELISA નું આ સંસ્કરણ કરતી વખતે, નક્કર તબક્કા પર શોષાયેલી અત્યંત વિશિષ્ટ પોલી- અથવા મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ પરીક્ષણ નમૂના સાથે ઉકાળવામાં આવે છે. ધોવાની પ્રક્રિયા પછી, સમાન એન્ટિજેનમાં એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝ (સંયુક્ત) કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે અને પછી પ્રતિક્રિયાના અન્ય તમામ તબક્કાઓ હાથ ધરવામાં આવે છે. વિશ્લેષણના દરેક તબક્કે ચોક્કસ સંકુલની રચનાની કાર્યક્ષમતા એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી પ્રતિક્રિયાના બંધનકર્તા સ્થિરાંક પર આધારિત છે.

વિશ્લેષણના મુખ્ય તબક્કાઓ:

1. મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ અથવા એફિનિટી-પ્યુરિફાઇડ પોલીક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ ઘન તબક્કા પર સ્થિર થાય છે.

2. પરીક્ષણ નમૂનાને પેનલના કૂવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે, અને સકારાત્મક નિયંત્રણ નમૂના અને વિવિધ મંદનમાં નકારાત્મક નિયંત્રણ નમૂના સમાંતર મૂકવામાં આવે છે. ઉકાળો અને ધોવા.

3. એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા મોનોક્લોનલ અથવા પોલીક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ – સંયુગ્ધ – કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે. સેવન પછી, ધોવા હાથ ધરવામાં આવે છે.

4. સબસ્ટ્રેટ ઉમેરવામાં આવે છે અને ઉકાળવામાં આવે છે. જ્યારે હકારાત્મક નિયંત્રણ કુવાઓમાં શ્રેષ્ઠ સ્ટેનિંગ પ્રાપ્ત થાય છે ત્યારે પ્રતિક્રિયા બંધ થાય છે.

5. ELISA રીડર પર પરિણામોનું રેકોર્ડિંગ.

પદ્ધતિનો મુખ્ય ફાયદો તેની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા છે, જે અન્ય ELISA યોજનાઓ (ફિગ. 4) ની ક્ષમતાઓ કરતાં વધી જાય છે.

આકૃતિ 3. એન્ટિબોડી શોધ માટે પરોક્ષ ELISA.

સ્પર્ધાત્મક ELISA.

આ પરીક્ષા ઘન તબક્કા પર શોષાયેલા એન્ટિજેન સાથે જોડાવા માટે લેબલ થયેલ (સંયુક્ત) અને લેબલ વગરના (પરીક્ષણ) એન્ટિબોડીઝની સ્પર્ધા પર આધારિત છે. ઘન તબક્કા સાથે જોડાયેલ એન્ઝાઇમની માત્રા મિશ્રણમાં મુક્ત એન્ટિબોડીઝની સામગ્રીના પ્રમાણમાં ઘટશે. એન્ટિજેન નક્કી કરવા માટે, સમાન વિકલ્પનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, પરંતુ આ કિસ્સામાં ઇચ્છિત એન્ટિજેન નક્કર તબક્કાની સપાટી પર સ્થિર એન્ટિબોડીઝ સાથે બંધન માટે લેબલવાળા, પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન સાથે સ્પર્ધા કરે છે.

સ્પર્ધાત્મક પદ્ધતિમાં ઓછામાં ઓછી સંખ્યાની કામગીરી, રીએજન્ટનો ઓછો વપરાશ અને સરળતાથી સ્વચાલિત થઈ શકે છે. એન્ટિબોડીઝને શોધવા માટે સ્પર્ધાત્મક ELISA કરતી વખતે, લેબલવાળા મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરવો વધુ સારું છે, પછી કન્જુગેટ ઘન તબક્કા પર શોષાયેલા એન્ટિજેનના એક એપિટોપ માટે પરીક્ષણ નમૂના સાથે સ્પર્ધા કરે છે. ELISA ના આ સંસ્કરણનો ઉપયોગ વિવિધ સંયોજનો નક્કી કરવા માટે થાય છે, જેમ કે માનવ ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન, કાર્સિનોએમ્બ્રીયોનિક એન્ટિજેન, ઇન્સ્યુલિન, વગેરે. તે ચેપી એજન્ટોના ડાયગ્નોસ્ટિકલી નોંધપાત્ર એપિટોપ્સ માટે એન્ટિબોડીઝને શોધવાની મંજૂરી આપે છે.

એન્ટિજેનને ઓળખવા માટેના વિશ્લેષણના મુખ્ય તબક્કાઓ (ફિગ. 5):

1. એન્ટિજેન માટે વિશિષ્ટ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ ઘન તબક્કામાં સ્થિર થાય છે.

2. એન્ઝાઇમ સાથે લેબલ થયેલ એન્ટિજેન અને પરીક્ષણ નમૂનાને જાણીતી સાંદ્રતામાં પેનલના કુવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે. ઇન્ક્યુબેશન અને ધોવા હાથ ધરવામાં આવે છે. સમાંતર, સકારાત્મક અને નકારાત્મક નિયંત્રણો અડીને આવેલા કુવાઓમાં મૂકવામાં આવે છે. માપાંકન રચવા માટે, વિવિધ ડિલ્યુશન્સમાં લેબલ વગરના પ્રમાણભૂત એન્ટિજેનનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે.

3. જ્યારે હકારાત્મક નિયંત્રણ કુવાઓમાં શ્રેષ્ઠ સ્ટેનિંગ વિકસે ત્યારે સબસ્ટ્રેટ ઉમેરો, ઉકાળો, પ્રતિક્રિયા બંધ કરો.

4. ELISA રીડર પર પ્રતિક્રિયા માટે એકાઉન્ટિંગ.

આ કિસ્સામાં, પરીક્ષણ નમૂનામાં એન્ટિજેનની માત્રા ઘન તબક્કા પર એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિના વિપરિત પ્રમાણસર છે.

અવરોધક ELISA.

ELISA ના આ સંસ્કરણમાં, પરીક્ષણ નમૂનામાં હાજર એન્ટિજેન એન્ઝાઇમ-લેબલવાળા મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ સાથે જોડાય છે અને નક્કર તબક્કા પર સ્થિર પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન સાથે તેમની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને અટકાવે છે. નમૂનામાં સંયોજક-વિશિષ્ટ એન્ટિજેનની સમાન ટ્રેસ માત્રાની હાજરી સ્થિર એન્ટિજેન સાથે લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝના બંધનને અટકાવશે. નિષેધની ડિગ્રી સોલ્યુશનમાં એન્ટિજેન સામગ્રીના સીધા પ્રમાણસર છે. જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ માટે, પ્રમાણભૂત એન્ટિજેનના સીરીયલ ડિલ્યુશનનો ઉપયોગ કરીને કેલિબ્રેશન વળાંક બનાવવામાં આવે છે. એન્ટિજેન શોધ માટે અવરોધક ELISA ના મુખ્ય તબક્કાઓ (ફિગ. 6).

1. પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન પેનલ્સના કુવાઓમાં શોષાય છે. લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝનું કાર્યકારી મંદન ટાઇટ્રેશન દ્વારા પસંદ કરવામાં આવે છે.

આકૃતિ 4. ELISA નું "સેન્ડવિચ" સંસ્કરણ.

આકૃતિ 5. સ્પર્ધાત્મક ELISA આકૃતિ 6. અવરોધક ELISA

2. પરિક્ષણ નમૂના, પ્રમાણભૂત એન્ટિજેન અને પોઝિટિવ કંટ્રોલ સેમ્પલના મંદન સાથે, સંયોજકનું પ્રી-ઈન્ક્યુબેશન કાર્ય કરતા પહેલાના મંદન દ્વારા કરવામાં આવે છે.

3. મિશ્રણને પેનલ્સના કુવાઓમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવે છે. 100% બંધનકર્તાને નિયંત્રિત કરવા માટે, અવરોધક એન્ટિજેન વિના, માત્ર લેબલવાળા એન્ટિબોડીઝને કેટલાક કૂવાઓમાં ઉમેરવામાં આવે છે. પેનલ્સ ઉકાળવામાં આવે છે અને પછી ધોવાઇ જાય છે.

4. સબસ્ટ્રેટ ઉમેરો.

5. પરિણામો રેકોર્ડ કરો.

પરીક્ષણ નમૂનામાં નક્કી કરવામાં આવતા એન્ટિજેનની સાંદ્રતા ઘન તબક્કા પર એન્ઝાઇમેટિક પ્રવૃત્તિના વિપરિત પ્રમાણસર છે.

ELISA નો ઉપયોગ માત્ર દ્રાવ્ય એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડી નક્કી કરવા માટે જ નહીં, પણ વિવિધ પ્રોટીન ઉત્પન્ન કરતા કોષો પણ કરી શકાય છે.

ઇમ્યુનોએન્ઝાઇમ ડાઘ પદ્ધતિ ( એલિસ્પોટ).

1983 માં, વિટ્રોમાં એન્ટિબોડીઝ અથવા એન્ટિજેન્સ (દા.ત., સાયટોકાઇન્સ) સ્ત્રાવતા લિમ્ફોઇડ કોષોને શોધવા માટે ELISA ટેક્નોલોજીને સ્વીકારવામાં આવી હતી. પદ્ધતિને ELISPOT (એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસ્પોટ સ્પોટ મેથડ) કહેવામાં આવે છે. પદ્ધતિનો મૂળભૂત સિદ્ધાંત:

1. પોલિસ્ટરીન કૂવાની સપાટી પર (કોષ સંવર્ધન માટે 24-વેલ પેનલનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે), એન્ટિજેન્સ અથવા એન્ટિબોડીઝને સોર્બ કરવામાં આવે છે, જે "ટ્રેપ" રીએજન્ટ તરીકે સેવા આપે છે.

2. અભ્યાસ કરવાના લિમ્ફોઇડ કોષોને 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ તાપમાને કેટલાક કલાકો સુધી ઉમેરવામાં આવે છે અને સંવર્ધન કરવામાં આવે છે, જે તેમને ચોક્કસ સ્થાન પર કબજો કરવાની અને પ્રદર્શન કરવાની તક આપે છે. ગુપ્ત કાર્ય. આવા કોષો દ્વારા સ્ત્રાવ કરાયેલ એન્ટિબોડીઝ અથવા એન્ટિજેન્સ ઘન તબક્કા પર શોષાયેલા રીએજન્ટ્સ દ્વારા કબજે કરવામાં આવે છે.

3. કોષોને ધોવાના સોલ્યુશનનો ઉપયોગ કરીને ડીટરજન્ટથી દૂર કરવામાં આવે છે જે કોષોને લીસ કરે છે.

4. એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ એન્ટિબોડીઝ (એન્ટિગ્લોબ્યુલિન રીએજન્ટ) ઉમેરીને સ્ત્રાવના ઉત્પાદનોના સંચયના વિસ્તારો જાહેર કરવામાં આવે છે.

5. સબસ્ટ્રેટ અને એગેરોઝનું મિશ્રણ ઉમેરવામાં આવે છે (વપરાતા સબસ્ટ્રેટ એગેરોઝમાં ઓગળવા જોઈએ અને અદ્રાવ્ય પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદનો બનાવવું જોઈએ), ઘન તબક્કાની સપાટી પર ભૂરા અથવા વાદળી ફોલ્લીઓ રચાય છે (ઉપયોગમાં લેવાતા ઉત્સેચકો અને સબસ્ટ્રેટ પર આધાર રાખીને), તે વિસ્તારોને જાહેર કરે છે જ્યાં કોષો હોય છે. સ્થિત હતા.

પરિણામી ફોલ્લીઓ માઇક્રોસ્કોપ હેઠળ ગણવામાં આવે છે, આ સ્ત્રાવના કોષોની સંખ્યા હશે.

નાઈટ્રોસેલ્યુલોઝ મેમ્બ્રેનનો ઉપયોગ નક્કર તબક્કા તરીકે થઈ શકે છે. આ કિસ્સામાં, ત્યાં ઘણા બધા ફાયદા છે: NCM ની ઉચ્ચ શોષણ ક્ષમતાને લીધે, એન્ટિજેનની નોંધપાત્ર રીતે ઓછી માત્રાની જરૂર પડે છે, જેનો ઉપયોગ "ટ્રેપ" રીએજન્ટ તરીકે થાય છે; વધુમાં , સબસ્ટ્રેટમાં એગરોઝનો સમાવેશ કરવાની જરૂર નથી.

જ્યારે એકસાથે સ્ત્રાવના કોષોની સંખ્યા નક્કી કરવામાં આવે છે અને કુલ સંખ્યાકૂવામાં સ્ત્રાવિત એન્ટિજેન અથવા એન્ટિબોડી, જે અલગ સબસ્ટ્રેટનો ઉપયોગ કરતી વખતે શક્ય છે, એક કોષ દ્વારા સ્ત્રાવિત પદાર્થની માત્રા નક્કી કરવી શક્ય છે.

આ પદ્ધતિ મળી વિશાળ એપ્લિકેશનશોષિત એન્ટિબોડીઝ દ્વારા કબજે કરાયેલા એન્ટિજેન સ્ત્રાવતા કોષોની સંખ્યાનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, તેનો ઉપયોગ સાયટોકાઇન્સ (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-α) સ્ત્રાવતા કોષોની સંખ્યા નક્કી કરવા માટે થાય છે.

સિગ્નલ એમ્પ્લીફિકેશન સિસ્ટમ્સ.

હાઇ-એફિનિટી એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરતી વખતે, વ્યક્તિગત ELISA ચલોની સંવેદનશીલતા ખૂબ ઊંચી હોય છે અને સૈદ્ધાંતિક રીતે સિંગલ એન્ટિજેન પરમાણુઓ શોધવાની મંજૂરી આપે છે, પરંતુ વ્યવહારમાં સંવેદનશીલતા સંખ્યાબંધ પરિબળો દ્વારા મર્યાદિત છે: એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ, સિગ્નલની તીવ્રતા અને સિગ્નલ રેકોર્ડિંગ પદ્ધતિઓ. સિગ્નલ એમ્પ્લીફિકેશન સિસ્ટમ્સ વિવિધ ELISA વિકલ્પોની સંવેદનશીલતા વધારવાનું શક્ય બનાવે છે. ચાલો આમાંની કેટલીક સિસ્ટમો જોઈએ:

એવિડિન-બાયોટિનની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના આધારે.

બાયોટીન સહઉત્સેચક અણુઓ (mw 244 Da) બાયોટીનીલ-એન-હાઈડ્રોક્સીસુસીમાઈડનો ઉપયોગ કરીને એન્ટિબોડીઝ સાથે સંયોજિત થાય છે. એક નાનો બાયોટિન પરમાણુ તેના રોગપ્રતિકારક અથવા એન્ઝાઈમેટિક ગુણધર્મોને ખલેલ પહોંચાડ્યા વિના ઇમ્યુનોગ્લોબ્યુલિન અથવા અન્ય પ્રોટીન સાથે જોડવાનું સરળ છે. આ કિસ્સામાં એન્ઝાઇમ ગ્લાયકોપ્રોટીન સાથે સંકળાયેલ છે ઇંડા સફેદએવિડિન બાયોટિન સાથે એવિડિનનું બંધનકર્તા જોડાણ ખૂબ વધારે છે (કોમ્પ્લેક્સનું વિયોજન સ્થિરાંક 10 -15 mol છે), એવિડિન-એન્ઝાઇમ સંયુગેટ એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી-બાયોટિન સંકુલ સાથે નિશ્ચિતપણે નિશ્ચિત છે. યોગ્ય સબસ્ટ્રેટ ઉમેર્યા પછી, પ્રતિક્રિયા ઉત્પાદન સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિકલી અથવા લ્યુમિનેસેન્સની તીવ્રતા દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે.

એવિડિનનો એક પરમાણુ ચાર સરખા સબ્યુનિટ્સ ધરાવે છે અને તે બાયોટીનના ચાર પરમાણુઓ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરવા સક્ષમ છે, જે તેને બે બાયોટિન ધરાવતા સંયોજનો વચ્ચે લિંકિંગ પરમાણુ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાની મંજૂરી આપે છે. આ કિસ્સામાં, એન્ઝાઇમ પણ બાયોટિનિલેટેડ છે, અને એવિડિન એક પુલ તરીકે કાર્ય કરે છે, જે બાયોટિન અવશેષો ધરાવતા બે પરમાણુઓને જોડે છે. પરિણામી એન્ટિજેન-એન્ટિબોડી-બાયોટિન કોમ્પ્લેક્સમાં ફ્રી એવિડિન અને પછી એક બાયોટિનીલેટેડ એન્ઝાઇમ ઉમેરવામાં આવે છે. પ્રતિક્રિયા ધ્યાનમાં લેવામાં આવે છે.

એવિડિન પ્રોટીન અન્ય પરમાણુઓ પર બિન-વિશિષ્ટ રીતે શોષાઈ શકે છે, તેથી અન્ય બાયોટિન-બંધનકર્તા પ્રોટીન, સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન, બેક્ટેરિયા સ્ટ્રેપ્ટોમીસીસ એવિડિનીમાં જોવા મળે છે, તેનો ઉપયોગ વધુને વધુ થઈ રહ્યો છે. સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન પણ બાયોટિન સાથે મજબૂત સંકુલ બનાવે છે અને તેમાં ચાર સરખા સબ્યુનિટ્સનો સમાવેશ થાય છે.

એવિડિન-બાયોટિન કોમ્પ્લેક્સનો ઉપયોગ ELISA ની સંવેદનશીલતામાં નોંધપાત્ર વધારો કરી શકે છે, કારણ કે જ્યારે એક એટી પરમાણુ સાથે સંયોજકનું સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે, ત્યારે ડઝનેક બાયોટિન પરમાણુઓ બંધાઈ શકે છે. કન્જુગેટ્સ (બાયોટિન સાથે એન્ટિબોડીઝ અને ઉત્સેચકો) મેળવવું એકદમ સરળ છે અને તેની સાથે છે ન્યૂનતમ ફેરફારોતેમની રોગપ્રતિકારક અને એન્ઝાઈમેટિક પ્રવૃત્તિ. બાયોટિન સાથેના એન્ઝાઇમ સંયોજકોનો ઉપયોગ સાર્વત્રિક રીએજન્ટ તરીકે થઈ શકે છે.

કેમિલ્યુમિનેસેન્ટ પ્રતિક્રિયાઓનો ઉપયોગ.

ELISA માં સિગ્નલ મેળવવા માટે કેમિલ્યુમિનેસન્ટ પ્રતિક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે, જે પદ્ધતિની સંવેદનશીલતા વધારે છે અને વિશ્લેષણનો સમય ઘટાડે છે. Horseradish peroxidaseનો વ્યાપકપણે ELISA માં લેબલ તરીકે ઉપયોગ થાય છે; તેને શોધવા માટે વિવિધ કેમીલ્યુમિનેસન્ટ પ્રતિક્રિયાઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. કેમિલ્યુમિનેસેન્ટ પ્રતિક્રિયાઓ હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ સાથે ઓક્સિડાઇઝ કરવામાં આવે ત્યારે લ્યુમિનોલની ચમકવાની ક્ષમતા પર આધારિત છે. IN સીધું વિશ્લેષણએન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયા દરમિયાન, હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ રચાય છે અને લ્યુમિનોલને ઓક્સિડાઇઝ કરે છે; આ પ્રતિક્રિયા માટે ઉત્પ્રેરક હોર્સરાડિશ પેરોક્સિડેઝ છે. સિગ્નલને વધારવા માટે, વિવિધ સંયોજનોનો ઉપયોગ કરવામાં આવે છે, ઉદાહરણ તરીકે, લ્યુસિફેરિન, ફિનોલ્સ, આ કિસ્સામાં લ્યુમિનેસેન્સની તીવ્રતા 10-100 ગણી વધારે છે, કેટલાક કિસ્સાઓમાં 500 ગણી (ઉન્નત કેમિલ્યુમિનેસેન્ટ વિશ્લેષણ). લ્યુમિનેસેન્ટ સિગ્નલ ખૂબ જ સ્થિર છે, તેનું સ્તર 30 સેકન્ડમાં મહત્તમ સુધી પહોંચે છે (સરખામણી માટે: સૂચક તરીકે OFD સાથેની રંગ પ્રતિક્રિયા માત્ર 30 મિનિટમાં સંપૂર્ણપણે વિકસિત થાય છે).

પરોક્ષ વિશ્લેષણમાં, એન્ટિબોડીને લ્યુમિનોલ અથવા તેના ડેરિવેટિવ્ઝ સાથે લેબલ કરવામાં આવે છે. મુક્ત સ્થિતિમાં આવા લેબલને હાઇડ્રોજન પેરોક્સાઇડ દ્વારા ઓક્સિડાઇઝ કરી શકાય છે, પ્રકાશ મુક્ત કરી શકાય છે. જો તે એક જટિલ રચના કરે છે, તો તે તેની ઓક્સિડાઇઝ કરવાની ક્ષમતા ગુમાવે છે.

કાસ્કેડ સિસ્ટમો પર આધારિત.

ELISA ની સંવેદનશીલતા વધારવા માટે એન્ઝાઇમ કાસ્કેડ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરી શકાય છે. આ કિસ્સામાં, પ્રથમ એન્ટિબોડી-બાઉન્ડ એન્ઝાઇમ બીજા એન્ઝાઇમ સિસ્ટમ માટે ઘટાડી શકાય તેવું સબસ્ટ્રેટ બનાવે છે. બીજી એન્ઝાઇમ સિસ્ટમ સબસ્ટ્રેટ-ચક્રીય અથવા રેડોક્સિસાયક્લિક હોઈ શકે છે. આ કિસ્સામાં એન્ઝાઇમ ટૅગ્સ ફોસ્ફો-ગ્લુકોઇસોમેરેઝ, એલ્ડોલેઝ, આલ્કલાઇન ફોસ્ફેટસ. અંતિમ ઉત્પાદનપ્રતિક્રિયાઓ દૃષ્ટિની અથવા સ્પેક્ટ્રોફોટોમેટ્રિક રીતે નક્કી કરવામાં આવે છે.

ELISA એમ્પ્લીફિકેશન સિસ્ટમ્સ ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા પ્રાપ્ત કરી શકે છે. આવી ELISA સિસ્ટમનો ઉપયોગ હોર્મોન્સ (થાઇરોઇડ-સ્ટિમ્યુલેટિંગ, પ્રોજેસ્ટેરોન, વગેરે) નું સ્તર નક્કી કરવા માટે થાય છે.

ELISA ની પ્રાયોગિક એપ્લિકેશન.

ELISA ને પદ્ધતિની સાપેક્ષ સરળતા અને ઉચ્ચ સંવેદનશીલતાને કારણે દવા અને જીવવિજ્ઞાનના વિવિધ ક્ષેત્રોમાં વ્યાપક એપ્લિકેશન મળી છે. ELISA સફળતાપૂર્વક આ માટે ઉપયોગમાં લેવાય છે:

જૈવિક નમૂનાઓમાં હોર્મોન્સ અને દવાઓનું સ્તર શોધી કાઢવું ​​અને નક્કી કરવું;

ચોક્કસ એન્ટિજેન સામે એન્ટિબોડીઝના આઇસોટાઇપ્સ (આઇજીજી, આઇજીએમ અને અન્ય) નું નિર્ધારણ;

રોગપ્રતિકારક સંકુલની ઓળખ;

ગાંઠ માર્કર્સની ઓળખ;

સીરમ પ્રોટીનનું નિર્ધારણ (ફેરીટીન, ફાઈબ્રોનેક્ટીન, વગેરે);

કુલ IgE અને ચોક્કસ IgE એન્ટિબોડીઝનું નિર્ધારણ;

મ્યોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝ માટે સ્ક્રીનીંગ;

જૈવિક પ્રવાહીમાં સાયટોકીન્સનું નિર્ધારણ.

પદ્ધતિની સંવેદનશીલતા

ELISA એ ક્લિનિકલ પ્રેક્ટિસમાં અગાઉ વ્યાપકપણે ઉપયોગમાં લેવાતી એગ્ગ્લુટિનેશન, રેસિપિટેશન અને RIA પદ્ધતિઓનું સ્થાન લીધું છે. ઉપરોક્ત પદ્ધતિઓની તુલનામાં, ELISA ઓછી શ્રમ-સઘન અને ઓછો સમય લેતી હોય છે, અને મોટી સંખ્યામાં સમાન પરીક્ષણો કરવા માટે અનુકૂળ છે.

ELISA એ એન્ઝાઇમ લેબલ નક્કી કરવાની ઉચ્ચ સંવેદનશીલતા સાથે ઇમ્યુનોકેમિકલ વિશ્લેષણની અનન્ય વિશિષ્ટતાને જોડે છે. પદ્ધતિની સંવેદનશીલતા (સંવેદનશીલતાનો અર્થ એન્ટિબોડીઝ અથવા એન્ટિજેનની ન્યૂનતમ શોધી શકાય તેવી માત્રા છે) નીચેના પરિબળો દ્વારા નક્કી કરવામાં આવે છે: એન્ટિબોડીઝની સંલગ્નતા, મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ પ્રાધાન્યક્ષમ છે; ચોક્કસ એન્ઝાઇમ પ્રવૃત્તિ; સિગ્નલની તીવ્રતા; સિગ્નલ મીટરિંગ સંવેદનશીલતા. વિવિધ ELISA વિકલ્પો તેમની સંવેદનશીલતામાં બદલાય છે. ઘન-તબક્કાના ELISA ના અમુક પ્રકારો નમૂનામાં એક પરમાણુ શોધવાનું શક્ય બનાવે છે. ELISA ની સરેરાશ સંવેદનશીલતા 10 -9 – 10 -12 mol છે.

ગ્રંથસૂચિ.

1. Galaktionov V.G. ઇમ્યુનોલોજી. મોસ્કો યુનિવર્સિટી પબ્લિશિંગ હાઉસ, 1998
2. કિષ્કુન એ.એ. રોગપ્રતિકારક અભ્યાસ અને ક્લિનિકલ પ્રેક્ટિસમાં ચેપી રોગોના નિદાન માટેની પદ્ધતિઓ. તબીબી માહિતી એજન્સી, 2009
સિફિલિસના નિદાન માટે અન્ય પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરી શકાય છે: પ્રતિક્રિયા સાથે એન્ઝાઇમ-લિંક્ડ ઇમ્યુનોસોર્બન્ટ એસે (ELISA)...